Clonaggio funzionale Clonaggio posizionale

Presentazione sul tema: "Clonaggio funzionale Clonaggio posizionale"— Transcript della presentazione:

1 Clonaggio funzionale Clonaggio posizionale
Conoscenza proteina Malattia genetica Determinazione sequenza aminoac. Mappatura genetica con marcatori polimorfici Deduzione sequenza nucleotidica Identificazione cloni genomici che coprono il sito mappato Sintesi sonda oligonucleotidica Ricerca del gene (varie tecniche) Isolamento clone di cDNA Deduzione della struttura aminoac. Isolamento clone genomico Ricerca mutazioni nucleotidiche nelle famiglie affette Caratterizzazione clone genomico Ricerca di mutazioni nucleotidiche Ricerca funzione proteica

2 CLONAGGIO IN VETTORI PROCARIOTICI
Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

3 CARATTERISTICHE VETTORE PLASMIDICO DI CLONAGGIO
Origine autonoma di replicazione (ORI) - Geni per la selezione: resistenza ad uno o due antibiotici - Altri geni per la selezione del plasmide ricombinante - Siti multiplo di clonaggio

4 oppure elettroporazione
T. A. Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Zanichelli editore S.p.A Copyright © 2007

5 su terreno con antibiotico
Piastramento su terreno con antibiotico T. A. Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Zanichelli editore S.p.A Copyright © 2007

6 Selezione per la presenza del vettore: resistenza ad antibiotico
T. A. Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Zanichelli editore S.p.A Copyright © 2007

7 VETTORI DI CLONAGGIO PER E. coli
Tipo Dimensioni (kb) Dimensioni inserto (kb) Sistema selezione Metodo introduzione Plasmidi pBR ,  Antibiotici Trasformazione pUC , Amp + Lac Z Trasformazione Batteriofago lambda Infezione Fago filamentoso M ,  Lac Z Trasfezione Cosmidi Antibiotico Infezione Cromosomi artificiali fino a Amp (CM) + Lac Z Elettroporazione BAC

8 Plasmide pBR322 Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

9 pBR322: screening delle colonie ricombinanti
Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

10 Griffiths et al. , GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S. p. A
Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

11 Vettori plasmidici (pUC18)
Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

12 Il gene LacZ codifica per il polipeptide β-galattosidasi (1021 a.a.)
Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

13 Non c’è complementazione
β-galattosidasi ATTIVA Ceppo di E.coli: gene Lac Z mutante: peptide parziale Vettore pUC: gene LacZ mutante: peptide parziale Complementano Ceppo di E.coli Lac Z mutante Vettore LacZ interrotto dal clonaggio Non c’è complementazione β-galattosidasi INATTIVA β-galattosidasi ATTIVA Colonie Blu Metabolizzato Terreno + X-Gal Colonie bianche Non metabolizzato β-galattosidasi INATTIVA X-Gal: 5-Bromo-4-Cloroindolil-β-galattoside (incolore) Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

14 (induttore)

15 Metodi di inserimento dei vettori ricombinanti nelle cellule batteriche
Trasformazione: plasmidi (DNA) trasformano cellule procariotiche rese competenti Infezione: fagi (DNA con capsidi) che lisano il batterio Trasfezione: come una trasformazione ma con DNA fagico senza capsidi per es: per introdurre la forma replicativa di M13 a doppio filamento Infezione: cosmidi (DNA con capsidi) che nel batterio si comportano come plasmidi

16 BATTERIOFAGO LAMBDA COME VETTORE DI CLONAGGIO
Lambda w.t. = 50 Kb Estremità “cos” di 12 nt per circolarizzazione Infezione di E. coli

17 Batteriofago lambda

18 Griffiths et al. , GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S. p. A
Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

19 Batteriofago lambda Lambda w.t. = 50 Kb
Lambda di sostituzione: eliminati geni ciclo lisogenico, componenti capside: inserti fino a 23 Kb Clonaggio di frammenti DNA esogeno e packaging in vitro per costituzione particelle fagiche per infezione batterica Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

20 Creati siti unici per clonaggio
Formazione di catenani T. A. Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Zanichelli editore S.p.A Copyright © 2007

21 Fago difettivo (siti cos alterati) non può replicarsi ma produce
proteine per i capsidi che possono essere purificate Fagi difettivi che da soli non producono capsidi. Le singole proteine possono essere purificate Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

22 CLONAGGIO IN BATTERIOFAGI
Placche di lisi Tappeto batterico Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

23 Screening placche di lisi
Infezione fagica Screening placche di lisi Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

24 Fago filamentoso

25 Fago filamentoso La cellula batterica non viene lisata!
Infetta solo i ceppi F+ attraverso il pilo codificato dal fattore F La cellula batterica non viene lisata! Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

26 Griffiths et al. , GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S. p. A
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27 Fago filamentoso Clonaggio nella forma replicativa a doppia elica,
Trasfezione del ricombinante senza capsidi Genoma modificato con inserzione LacZ parziale Selezione colonie per il colore

28 Metodi di inserimento dei vettori ricombinanti nelle cellule batteriche
Trasformazione: plasmidi (DNA) trasformano cellule procariotiche rese competenti Infezione: fagi (DNA con capsidi) che lisano il batterio Trasfezione: come una trasformazione ma con DNA fagico senza capsidi per es: per introdurre la forma replicativa di M13 a doppio filamento Trasduzione: cosmidi (DNA con capsidi) che nel batterio si comportano come plasmidi

29 Clonaggio in cosmidi Formazione di catenani Formazione di colonie
Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

30 CROMOSOMI ARTIFICIALI DI BATTERIO (BAC)
Fattore di fertilità F di E. coli ha 3 geni (parA, parB, repE) per la replicazione e per mantenere basso il numero di copie del fattore (1- 2 per cellula) Gene per la resistenza al cloramfenicolo (per selezione trasformanti) Siti di clonaggio nel gene LacZ (identificazione ricombinanti per complementazione) Inserto tra 150 e 350 Kb Integrazione batterica per elettroporazione Promotori per la trascrizione (promotore fagico T7 e promotore del fagico SP6)

31 Griffiths et al. , GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S. p. A
Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

32 VETTORI DI CLONAGGIO IN LIEVITO: YAC (YEAST ARTIFICIAL CHROMOSOME)
Saccharomyces cerevisiae: 16 cromosomi da 250 kb a 2 Mb

33 Sferoplasting: liticasi
Inserto: 300 kb – 1 Mb Sferoplasting: liticasi Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

34 ARS = sequenze autonome di replicazione
SUP 4 CEN = Centromero ARS = sequenze autonome di replicazione TRP1 e URA3 per selezione di molecole con entrambi i bracci URA 3 = gene per un enzima della sintesi dei nucleotidi pirimidinici TRP1 = gene per un enzima della sintesi del triptofano SUP 4 = gene per il tRNA per la tirosina che sopprime la mutazione non senso “ochre” nel gene ADE2 del ceppo di lievito ADE2 = gene per la sintesi di adenina: un precursore dell’adenina (fosforibosil amminoimidazolo) che sta a monte nella via biosintetica si accumula e dà colonie rosse S. cerevisiae (ceppo per il clonaggio): URA (-), TRP (-), ADE2 (-) per mutazione “ochre”. Nel codone UAU (tyr) nel gene ADE2 si verifica la mutazione “ochre” UAA “non senso” e diventa ADE2(-): l’adenina non viene sintetizzata e si accumula come premetabolita rosso

35 S. cerevisiae (w.t): crescono se nel in terreno c’è uracile e triptofano
S. cerevisiae (utilizzato per clonaggio): URA (-), TRP (-), ADE2 (-) per mutazione “ochre” accumulo di premetabolita dell’adenina colonie rosse YAC con gene SUP 4 = gene per il tRNA con UAA Tyr* SUP 4 integro sopprime la mutazione non senso “ochre” nel gene ADE2 del ceppo di lievito: viene sintetizzata adenina, non c’è accumulo di premetabolita rosso colonie bianche S. cerevisiae (terreno minimo) + YAC senza inserto (SUP attivo) colonie bianche S. cerevisiae (terreno minimo) + YAC con inserto (SUP inattivo) colonie rosse

36 VANTAGGI E SVANTAGGI DEL CLONAGGIO IN YAC:
- Chimerismo (co-saldatura di più regioni nello stesso YAC) - Instabilità (soprattutto a livello di regioni ripetute) - Co-trasformazione (più di uno YAC per cellula di lievito) Distribuzione dei cloni in griglie Produzione di filtri con i singoli cloni da utilizzare in screening Allineamento dei cloni in contigui

37 ALLINEAMENTO DI YAC PER CONTENUTO DI STS