ESTRAZIONE Esempi di metodologie LA PROCEDURA ADOTTATA DIPENDE:

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1 ESTRAZIONE Esempi di metodologie LA PROCEDURA ADOTTATA DIPENDE:
Dalla fonte: Origine Esempi di metodologie cellule animali -shock osmotico o lisi osmotica -cicli di congelamento e scongelamento -digestione enzimatica -solventi organici cellule vegetali -metodi meccanici** microrganismi -lisozima ** rottura meccanica con agenti abrasivi, frullatori, omogeneizzatori,estrusione ad alta pressione, ultrasuoni.

2 Dalla localizzazione cellulare:
proteine extracellulari proteine intracellulari e presenti negli organelli cellulari proteine di membrana

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4 CROMATOGRAFIA PER GEL FILTRAZIONE (o esclusione molecolare)
Si basa sulle DIFFERENTI DIMENSIONI dei soluti da separare FASE MOBILE: solvente FASE STAZIONARIA: granuli di gel idratato poroso (chimicamente inerte) P = r g h Livello minimo di sicurezza dell’eluente

5 CROMATOGRAFIA PER GEL FILTRAZIONE (esclusione molecolare)
Si basa sulle DIFFERENTI DIMENSIONI dei soluti da separare

6 Fase stazionaria: granuli di gel idratato poroso (chimicamente inerte)
Fase mobile: solvente I soluti di dimensioni minori possono penetrare nei pori, e migrano più lentamente I soluti le cui dimensioni superino il diametro dei pori (limite di esclusione), ne rimangono esclusi, e passano più velocemente attraverso gli spazi interstiziali dei granuli

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8 Un singolo granulo di gel (in giallo) è qui schematicamente rappresentato come una struttura sferica contenente dei pori: - le particelle grandi (in rosso) non riescono a penetrare nei pori e passano più rapidamente attraverso la fase stazionaria, eluendo per prime dalla colonna; - le particelle più piccole (in blu), penetrando nei pori dei granuli di gel, ne vengono “intrappolate” cosicché la loro corsa lungo la colonna è rallentata, in proporzione alle dimensioni.

9 Per ogni soluto i, si definiscono KDi e VEi :
VO = Volume vuoto o interstiziale VX = Volume dei granuli di gel VT = Volume totale VT VX V0 VT = VO + VX VEi = Volume di Eluizione (V di solvente necessario ad eluire il soluto i ) Per ogni soluto i, si definiscono KDi e VEi : KDi = Coefficiente di distribuzione (frazione di ripartizione di i tra VX e VT ) VEi = VO + KDi VX 0 < KDi < 1 VEi / VO è il volume di eluizione relativo (indipendente dalla colonna e dal gel)

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11 Nome commerciale Materiale Campo di frazionamento (kD)
Sono commercialmente disponibili diversi tipi gel polimerici, a seconda del LIMITE DI ESCLUSIONE e dell’ INTERVALLO o CAMPO DI FRAZIONAMENTO Nome commerciale Materiale Campo di frazionamento (kD) Sephadex G Destrano Sephadex G Destrano Sephadex G Destrano Sephadex G Destrano Sephadex G Destrano Bio-Gel P Poliacrilammide Bio-Gel P Poliacrilammide Bio-Gel P Poliacrilammide Bio-Gel P Poliacrilammide Bio-Gel P Poliacrilammide Bio-Gel P Poliacrilammide Sepharose 6B Agarosio Sepharose 4B Agarosio Sepharose 2B Agarosio

12 Struttura del destrano, una resina polimerica in commercio con il nome di Sephadex

13 STADI DEL PROCESSO Scelta del gel. La resina è venduta in forma DISIDRATATA. È necessario perciò idratare la resina (RIGONFIAMENTO) con acqua o con il solvente della miscela proteica. È opportuno DISAERARE il gel con una beuta da vuoto prima del caricamento. Il caricamento della colonna va effettuato lentamente, onde evitare la formazione di bolle d’aria. Si sovrappone alla fase stazionaria la soluzione della miscela proteica da separare Si fa fluire la fase mobile (soluzione tampone) generalmente mediante una pompa peristaltica Si raccoglie l’eluito in provette con un collettore, e lo si analizza attraverso un rivelatore, in genere uno spettrofotometro

14 Cromatogramma o grafico di eluizione
che mostra la separazione completa dei componenti il campione da analizzare A280 nm Veluizione o numero della provetta La cromatografia ad esclusione viene utilizzata non solo per la separazione di composti biologici, ma anche per la determinazione del peso molecolare

15 Costruzione CURVA DI TARATURA
Il Veluizione relativo (VEi / VO) varia linearmente con il logaritmo del peso molecolare

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18 Cromatografia a scambio ionico

19 Cromatografia per affinità

20 Cromatografia per affinità

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