Western Blotting.

Presentazione sul tema: "Western Blotting."— Transcript della presentazione:

1 Western Blotting

2 Southern Blot: Per l’analisi del DNA.
(sonda = DNA o RNA). Northern Blot: Per l’analisi dell’ RNA. Western Blot: Per l’analisi delle proteine. (sonda = anticorpo).

3 Cosa e’ un Western Blot? Una tecnica in cui le proteine:
sono separate mediante elettroforesi su gel successivamente trasferite su un supporto (membrana o filtro). Successivamente una specifica proteina viene identificata mediante la sua reazione specifica con un anticorpo.

4 Western Analysis Laboratory procedure that allows you to:
1. Verify the expression of a protein 2. Determine the relative amount of a protein present in different samples 3. Analyze protein-protein interactions

5 A cosa serve il Western Blot?
C’è la proteina che mi interessa? SDS-PAGE (non certo) Si basa sul confronto di peso molecolare Western blot (certo) Si basa su una reazione specifica antigene-anticorpo + – ?

6 A cosa serve il Western Blot?
Quanta proteina di interesse c’e’? Proteina di interesse Bande non specifiche [Proteina], pg

7 Fasi di un Western Blot Prima fase: elettroforesi su gel.
(Le proteine del campione vengono separate su un gel in base alle loro dimensioni) Seconda fase: trasferimento su membrana. (Le proteine nel gel sono poi trasferite su una membrana di nitrocellulosa mediante un campo elettrico) Terza fase: saturazione o “blocking”. (La saturazione e’ usata per prevenire le interazioni non specifiche tra l’anticorpo e la membrana)

8 - + SDS-PAGE Western Blot Method - - - - - - - -
Cell Lysis by Detergents and Sonication Cells in Culture Cell Removal Human Cells Containing Protein - SDS or LDS - - Heat Denaturation of Proteins - Detergents Bind Proteins - - - Load Proteins on Gel + - - Proteins Separate by Size Apply Electric Current

9 Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento
Le proteine nel gel sono ancora in soluzione Le bande diffondono e si confondono col tempo E’ necessaria l’immobilizzazione per: Preservare in maniera permanente l’esperimento di elettroforesi Permettere il riconoscimento di proteine specifiche La strategia piu’ comune e’ il trasferimento su membrana Nitrocellulosa PVDF (Polivinilidene fluoride) Nylon

10 Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento
membrana

11 Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento
Elettroblotting Apparato di trasferimento Il gel e’ messo tra strati di carta da filtro con la membrana a diretto contatto col gel sul lato verso l’elettrodo positive Viene applicato un campo elettrico e le proteine migrano fuori dal gel verso l’elettrodo positivo e si legano alla membrane Fatto a 4°C per evitare surriscaldamento, decomposizione del tampone e degradazione delle proteine

12 Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento
Trasferimento dal catodo (-) all’ anodo (+) Spugnette 3 fogli di carta da filtro imbevuti di tampone di trasferimento Gel Membrana Focus on left side of picture

13 Apparato per il trasferimento “Semi-dry”

14 Western Blotting - + SDS-PAGE Assemble ‘sandwich’ Wet blotting
Buffer-soaked filter papers Gel Nitrocellulose membrane Wet blotting Electrode Buffer Direction of transfer Semi-dry blotting Graphite Electrode Plates Nitrocellulose with bound proteins Stained (Red Ponceau)

15 Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento
Componenti del tampone di trasferimento: 25mM Tris 190mM glicina 20% metanolo Have your gel/membrane sandwich together, pour in transfer buffer into apparatus, apply current and proteins are transferred from gel to membrane.

16 3 overview 1. run protein on gel 2. transfer to membrane 3. block membrane to prevent non-specific binding 4. Probe membrane, primary ab bind to protein of interest, 2nd antibody binds to 1st antibody 5. substrate attaches to enzyme site on 2nd antibody, resulting in a colored protein band

17 Fasi di un Western Blot Prima fase: elettroforesi su gel.
(Le proteine del campione vengono separate su un gel in base alle loro dimensioni) Seconda fase: trasferimento su membrana. (Le proteine nel gel sono poi trasferite su una membrana di nitrocellulosa mediante un campo elettrico) Terza fase: saturazione o “blocking”. (La saturazione e’ usata per prevenire le interazioni non specifiche tra l’anticorpo e la membrana)

18 Western blot: terza fase saturazione o “blocking”
Per saturare i siti idrofobici liberi sulla membrane Per prevenire il legame dell’anticorpo primario alla membrana stessa Latte scremato o Albumina di Siero Bovino (BSA) reducing background

19 - - Transfer or Blot Protein from Gel to Nitrocellulose and/or PVDF Membrane - - Block Membrane with Non-Specific Proteins - Non-Specific Proteins Bind to Unbound Regions of Membrane

20 Fasi di un Western Blot Quarta fase: legame dell’anticorpo primario.
(L’anticorpo riconosce la proteina specifica immobilizzata sulla membrana)

21 Western blot: quarta fase incubazione con anticorpo primario
L’anticorpo primario riconosce la proteina di interesse e non lega le altre proteine immobilizzate sulla membrane Anticorpi come sonde: Molto sensibili Economici

22 - - Transfer or Blot Protein from Gel to Nitrocellulose and/or PVDF Membrane - - Block Membrane with Non-Specific Proteins - - Incubate Membrane with 1o Antibody 1o Antibody Binds Antigen (i.e. Protein of Interest) Non-Specific Proteins Bind to Unbound Regions of Membrane

23 Western blot: quarta fase incubazione con anticorpo primario

24 Western blot: quinta fase Incubazione con anticorpo secondario

25 Anticorpi Anticorpo primario Anticorpo secondario
Riconosce la proteina Anticorpo secondario Lega l’anticorpo primario Generalmente prodotto in una specie diversa Coniugato con un enzima Il substrato dell’enzima sara’ convertito in un prodotto colorato Puo’ anche essere radioattivo o fluorescente

26 - - - Add HRP-Conjugated 2o Antibody HRP Luminol Light
Detected by Film 2o Antibody is a Goat Anti-Rabbit-HRP-Conjugated Antibody Add Chemiluminescent Substrate

27 Fasi di un Western Blot Quarta fase: legame dell’anticorpo primario.
(L’anticorpo riconosce la proteina specifica immobilizzata sulla membrana) Quinta fase: legame dell’anticorpo secondario. (L’anticorpo secondario, coniugato a un enzima (AP o HRP), riconosce specificamente l’anticorpo primario, gia’ legato alla proteina sulla membrana)

28 Western blot: quinta fase Incubazione con anticorpo secondario

29 Fasi di un Western Blot Quarta fase: legame dell’anticorpo primario.
(L’anticorpo riconosce la proteina specifica immobilizzata sulla membrana) Quinta fase: legame dell’anticorpo secondario. (L’anticorpo secondario, coniugato a un enzima (AP o HRP), riconosce specificamente l’anticorpo primario, gia’ legato alla proteina sulla membrana) Sesta fase: rivelazione o “detection”. (L’enzima coniugato all’anticorpo secondario scinde un substrato che, in corrispondenza della proteina specifica, sviluppa precipitato colorato o chemioluminescenza)

30 Western blot: sesta fase rivelazione o “detection”
Fosfatasi alcalina (AP) o perossidasi del rafano (HRP: horseradish peroxidase) Conversione di un substrato colorimetrico in un precipitato colorato Substrati Chemioluminescenti Emettono luce se convertiti dall’enzima Possono essere visualizzati su lastre radiografiche Marcatura radioattiva Anticorpi secondari biotinilati Directly on the gel: Cooblue nonspecifically binds to virtually all proteins, silver stain more sensitive, permanent Alkaline phosphatase (blue) horseradish perox. (brown) AP more commonly used in plants vs. HRP in animals (AP present in all tissues in the body- cross reactive, HRP enzyme derived from plant, so better to use AP in plant applications I 125 a two-step biotin/avidin system may be used. A biotinylated secondary antibody is applied first, then avidin conjugated to an enzyme or fluorochrome binds to multiple sites on the biotinylated secondary antibody, thus amplifying the signal and resulting in greater sensitivity than that achieved with an antibody-enzyme or antibody-fluorochrome conjugate alone.

31 HRP Western blot substrato luce Anticorpo primario Anticorpo secondario Rivelazione Il substrato metabolizzato dalla perossidasi (HRP) emette luce pg proteina

32 Magic Mark XP Western Protein Standard
kDa 60 50 45 b-Actin 40 30 20 Invitrogen.com

33 Some Drawbacks of Western Blotting
1. Many steps where errors can occur 2. Large amount of sample needed (5-50 mg) Mention ELISA here and its benefits: Accurate quantitation possible with very little sample, shorter protocol with fewer steps where errors can occur. 3. Accurate quantitation is very difficult 4. Time consuming protocol

34 Far-western blotting Far-western blotting is a molecular biological method which is based on the technique of western blotting to detect protein-protein interaction in vitro. Usual western blotting uses an antibody to detect a protein of interest, far-western blotting uses a non-antibody protein, which can bind the protein of interest. far-western blotting is rather employed to detect protein:protein interactions.

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