Cromatografia su strato sottile-TLC La fase stazionaria è stratificata su di una superficie piatta La fase mobile sale per capillarità e trasferisce l’analita.

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1 Cromatografia su strato sottile-TLC La fase stazionaria è stratificata su di una superficie piatta La fase mobile sale per capillarità e trasferisce l’analita depositato sulla superficie in maniera dipendente dalla sua Kd. Rf = dist. migr. analita dall’origine/ dist. migr. solv. dall’origine

2 Le sostanze da analizzare, pure o in miscela, vengono depositate in soluzione diluita sulla fase stazionaria con l’aiuto di un capillare. Cromatografia su strato sottile-TLC

3 La lastrina viene poi immersa alla base nella fase mobile, avendo cura che il liquido non ricopra le sostanze depositate: Cromatografia su strato sottile-TLC

4 La fase mobile sale lungo la fase stazionaria per capillarità trascinando con se le sostanze. La corsa di una sostanza dipenderà dal grado di interazione di questa con la fase stazionaria. Quanto più polari sono i composti, tanto più verranno trattenuti dalla fase stazionaria Cromatografia su strato sottile-TLC

5 TLC di monosaccaridi Punto di caricamento Sviluppo della TLC Glc Fuc GlcA Fronte del solvente I monosaccaridi sonon composti polari grande affinità per la silice Il campione viene caricato da acqua o da solventi organici La TLC viene immersa nel solvente opportuno A fine corsa, dopo aver asciugato la TLC, si spruzza con reattivi per lo sviluppo del colore

6 Eluenti utilizzati per separare i monosaccaridi  2-propanolo-acqua 4:1 v/v  1-butanolo-acetone-acqua 4:5:1 v/v  1-butanolo-acido acetico acqua 5:4:1 v/v Visualizzazione dei monosaccaridi separati  Acido solforico in etanolo  Anisaldeide-acido solforico  Anilina-difenilammina-acido fosforico  Il reattivo si spruzza sulla TLC  La TLC viene riscaldata a 80-100 °C fino alla comparsa degli spots

7 Un processo separativo di tipo cromatografico ha quindi come risultato un profilo di concentrazione risolto nello spazio o nel tempo di forma gaussiana. IL PICCO CROMATOGRAFICO t R viene misurato nel punto di massimo del picco; W b viene ottenuto tracciando le tangenti al punto di flesso e misurando l’intercetta sulla linea di base W h è la larghezza del picco misurata al 50% dell’altezza W i è la larghezza del picco misurata ai punti di flesso

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11 PIATTI TEORICI La teoria dei piatti considera il sistema cromatografico come un sistema statico in equilibrio. Ciascun analita stabilisce un equilibrio di ripartizione tra la fase mobile e la fase stazionaria. Ciascuno di questi equilibri definisce un piatto teorico A fase mobile A fase stazionaria I quattro concetti importanti per capire ed ottimizzare le condizioni separative sono: k’ Fattore di capacità  Selettività N Efficienza del sistema (numero di piatti teorici) R Risoluzione Gli analiti vengono trascinati dalla fase mobile attraverso la fase stazionaria e separati in base alla loro differente affinità per le due fasi.

12 Il numero dei piatti teorici dipende dalla lunghezza del sistema separativo, per questo è utile ricavare l’altezza equivalente del piatto teorico (HETP), che generalmente si esprime in millimetri. EFFICIENZA SEPARATIVA lunghezza della colonna in mm Il concetto di piatto è usato nella distillazione frazionata, dove si considera che ogni stadio di condensazione/evaporazione avvenga su un diverso livello o piatto (questi piatti esistono effettivamente in molte colonne di distillazione) In cromatografia i piatti sono una rappresentazione teorica degli stadi di ripartizione (distribuzione) che le molecole incontrano durante il loro passaggio nel sistema separativo. L’efficienza è tanto più elevata quanto minore è H e maggiore è N.

13 Quindi l’efficienza separativa è un indice di quanto si riesca ad evitare l’allargamento di banda durante la corsa cromatografica. Occorre comunque considerare che all’aumentare del tempo di residenza dell’analita nella colonna diventano sempre più importanti i fenomeni di diffusione laterale lungo la colonna stessa e che quindi i picchi che escono a tempi di ritenzione elevati saranno sempre più larghi di quelli che escono prima. Esistono inoltre allargamenti di banda extra-colonna, dovuti alla diffusione laterale che avviene nei tubi di connessione e nella cella del rivelatore, che devono essere ridotti al minimo mediante un opportuno disegno strumentale. FATTORI INFLUENZANTI L’EFFICIENZA

14 Random Elements to Motion  Random length of time that each molecule spends in the stationary phase  Longitudinal diffusion: solute molecules tend to diffuse from more to less concentrated regions. Therefore some molecules move faster, some move slower than average in direction of flow  Eddy diffusion: if the column is packed with particles of (or supporting) the stationary phase - there are many possibilities for differing routes down the column: All of these mechanisms have more time to operate, the longer the column. Hence increased line broadening down the column

15 LONGITUDINAL DIFFUSION (MOBILE PHASE) Longitudinal diffusion in column chromatography is a band broadening process in which analytes diffuse from the concentrated center of a band to the more dilute regions ahead of and behind the band center. Toward and opposed to the direction of flow of the mobile phase. B is directly proportional to the diffusion coefficient, which is a constant equal to the rate of migration under a unit concentration gradient. The diffusion coefficients in liquids are orders of magnitude smaller than those in gases and therefore the role of the B term plays a small role on the band broadening in HPLC

16 VAN DEEMTER EQUATION HETP = H = A + B/  + C  A - Multipath effect (Eddy diffusion) B/  - Longitudinal diffusion C  - Mass transfer term

17 FATTORE DI CAPACITA` Il fattore di capacità di un composto esprime il suo tempo (volume) di ritenzione corretto rispetto al tempo (volume) morto ed è calcolato come segue: Il fattore di capacità è simile ad una costante di equilibrio. Rappresenta la misura del tempo trascorso in/sopra la fase stazionaria rispetto al tempo di residenza nella fase mobile durante il passaggio attraverso il sistema separativo. Maggiore è il fattore di capacità, più alto è il tempo trascorso in/sopra la fase stazionaria e più tardi il composto eluisce. Il fattore di capacità è indipendente dalla velocità di flusso e dal sistema in generale. E`una funzione della capacità di ritenzione del sistema separativo accoppiata alle interazioni della fase mobile. k’ (fattore di capacità) = (t R - t M ) / t M = t’ R / t M

18 Column Resolution A quantitative measure of the ability of a column to separate two analytes, A and B: Defined as follows: R s = 0.75  incomplete resolution R s = 1.5  essentially complete resolution For R s = 1.0, zone A contains 4% B and vice versa. For increased resolution use longer column - but (i) longer time & (ii) broader bands Usually compromise between resolution and speed of analysis

19 CROMATOGRAFIA LIQUIDA (L.C.) Gel filtrazione (Size-exclusion chromatography) Scambio ionico (Ion exchange chromatography) Affinità (Affinity chromatography) Separa sulla base delle dimensioni molecolari Utilizzo nelle fasi tardive di una purificazione La risoluzione dipende: -dalla lunghezza della colonna -dalle proprietà della resina - materiale (silice, gel) - granulometria - porosità - resistenza (rigidità) - dal volume del campione caricato Requisiti strumentali da semplici a sofisticati (per caduta, FPLC, HPLC) Sulla base di affinità molecolari nelle fasi precoci La risoluzione dipende: - dalla “capacità” della resina (porosità) - dalla sua affinità Requisiti strumentali semplici o nessuno (per caduta, batch) Sulla base della carica netta (+ o - ) nelle fasi precoci, ma non solo La risoluzione dipende: - dalla “capacità della resina (porosità) - dal pH dell’eluente - dal pI delle proteine da separare Requisiti strumentali da semplici a sofisticati (per caduta, FPLC e sue evoluzioni)

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25 Micro Pump @ 3μL/min. (Eldex MicroPro™) Test Valve Sample Loop (10 nL for Peptide Separation) Hot Sleeve™ Col. Heater (50 °C) ABI 783 UV Detector 3-nl Dionex LCP flow cell (220 nm) 0.3mm x 150mm C18 (Higgins Analytical) Instrumentation/Test Set-up (Peptide Analysis) 20μm ID Fused Silica Used For All Connections

26 Rheodyne

27 Columns Usually stainless steel (to withstand pressure), 1 - 5 mm diameter, ~5  m packing. Very efficient but limited length (cf. GC) because of pressure drop. Packing - usually silica Stationary phase - could be involatile liquid (like those in packed-column GC). More usual now to use similar chemical species actually bonded to the silica (longer column life), e.g. R can be non-polar (C 8 or C 18 hydrocarbon chain) or polar (amine, nitrile etc.).

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40 Detectors In both GC, HPLC – great effort to separate analytes. When the separated analytes leave the column, we need to detect them. What are the criteria for an ideal detector? It should be: UNIVERSAL (i.e. detects everything) SENSITIVE (i.e. detects a very small amount of everything) It should have a LINEAR RESPONSE (i.e. linear relationship between intensity of response and amount of analyte). It should give STRUCTURAL INFORMATION (i.e. tell you what the analyte is, even if you didn’t know beforehand).

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49 Detector amperometrico pulsato (PAD) Le aldeidi e i carboidrati riducenti si ossidano su di un elettrodo d’oro a pH alcalino L’elettrodo di lavoro, attraverso una serie di potenziali, viene ogni volta rigenerato La corrente che si sviluppa all’elettrodo viene misurata in funzione del tempo Il campione viene consumato in piccolissima parte Dal sistema eluisce il campione in soluzione alcalina Il sistema richiede grande manualità

50 Selective Detectors Very many possibilities - some of the more common:- ¶ - thermionic detection (mainly for N, P) ¶ - fluorescence ¶ - light-scattering ¶ - electron-capture detection (ECD) - especially for elements with high electron affinities (e.g. halogens) ¶ - UV - single wavelength or scanning ¶ - FTIR ¶ - mass spectrometry

51 CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO Spesso non è possibile definire in maniera chiara se la separazione degli analiti avvenga in base ad un processo di adsorbimento o di ripartizione, ovvero entrambi. Si parla quindi di cromatografia di adsorbimento/ripartizione, che viene suddivisa, in base alle polarità relative delle due fasi: Cromatografia in fase normale : la fase stazionaria è polare (ad es. silice), la fase mobile è non polare (ad es. n-esano o tetraidrofurano). I campioni polari vengono trattenuti nella colonna più a lungo di quelli non polari o poco polari. Cromatografia in fase inversa (RP) : la fase stazionaria è non polare (idrocarburo), la fase mobile è polare (ad es. acqua o alcol). I campioni poco o non polari vengono trattenuti nella colonna più a lungo di quelli polari. Utilizzando uno o l’altro metodo, l’ordine di eluizione dei composti si inverte, anche se non sempre in maniera esattamente speculare. FASE NORMALE E IN FASE INVERSA

52 Principle: Adsorption of analytes on the polar, weakly acidic surface of silica gel. Stationary Phase.: Silica (pH 2-8), Alumina (pH 2 - 12), Bonded Diol, and NH 2 Mobile Phase: Non-polar solvents (Hexane, CHCl 3 ) Applications: Non-polar and semi-polar samples; hexane soluble; positional isomers. Normal-Phase HPLC 30% Silica Gel 47% Silica based bonded phases –Diol –Amine –Cyano 3% Alumina 20% Chiral Bonded Phases

53 Reversed-Phase HPLC Principle: Partition of analytes between mobile phase and stagnant phase inside the pore space + adsorption on the surface of bonded phase. Stationary Phase: Hydrophobic surfaces of moieties bonded on silica (C18, C8, C5, Phenyl, CN) Mobile phase: Methanol or Acetonitrile and Water. Applications: ~80% of all separations done on RP HPLC. 80%Octadecylsilica (ODS, C18) 10%Octylsilica (C8) 5%Butylsilica (C4) 3% Phenyl 2%Cyano (CN)

54 REVERSED PHASE SEPARATION PRINCIPLE Nonpolar (nonspecific) interactions of analyte with hydrophobic adsorbent surface (-C18, C8, Phenyl, C4) Different sorption affinities between analytes results in their separation More polar analytes retained less Analytes with larger hydrophobic part are retained longer Almost no separation of structural isomers Nonspecific (hydrophobic) interactions are at least ten times weaker than polar small differences in component molecular structure could have a significant effect in their retention Reversed PhaseNormal Phase Octane, k’ = 4.3 Octanol, k’ = 3.5 Nonane, k’ = 7.8 Nonanol, k’ = 3.3

55 FASE STAZIONARIA In cromatografia liquida di adsorbimento, la fase stazionaria è un solido poroso. In cromatografia liquida di partizione si utilizza una fase stazionaria liquida, che riveste la superficie delle particelle di supporto. La fase stazionaria liquida è oggi costituita da una fase stabile chimicamente legata alla supporto, detta bonded phase (BP). Il supporto (o matrice) è generalmente costituito da silice: i gruppi OH della silice (silanoli) vengono utilizzati per legare chimicamente la fase stazionaria. Le fasi legate possono essere polari (ad es. con un ammino gruppo o un ciano gruppo), utilizzate in fase normale; oppure apolari (ad es. con una catena alchilica, come quella octadecilica, C18), usate in fase inversa. CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO

56 La superficie della silice presenta gruppi silanolici (Si-OH), i gruppi reattivi utilizzati per legare la fase stazionaria al supporto. La composizione in silanoli non è costante e regolare su tutta la superficie della silice. Nella silice di tipo A (di origine naturale) la presenza di metalli come impurezze causa ulteriore variabilità nella reattività dei silanoli. La silice di tipo B (di origine sintetica) ha una composizione più controllata. FASE STAZIONARIA: CHIMICA DELLA SILICE

57 La fase stazionaria liquida viene legata ai silanoli della silice per reazione con un silano contenente un gruppo reattivo (es. cloro). L’atomo di silicio è legato alla molecola della fase desiderata (qui mostrata come C 18 o octadecil) e a due piccoli gruppi laterali come il metile. FASE STAZIONARIA: DERIVATIZZAZIONE DELLA SILICE Si OH Si OH Si OH Si OH Si OH Si OH SUPPORTO SILICEO FASE STAZIONARIA LIQUIDA

58 Molti dei silanoli superficiali non reagiscono a causa dell’ingombro sterico. I silanoli che non reagiscono sono spesso chiamati “silanoli liberi”. Questo fenomeno è tanto più rilevante quanto maggiore è l’ingombro del legante(es. C18). Il grado di ricopertura, espresso in mol/m 2, è una misura della densità di fase sulla superficie della particella. Si O OH Si OH Si O OH Si O FASE STAZIONARIA: DERIVATIZZAZIONE DELLA SILICE

59 I silanoli liberi sono disponibili per altre interazioni con le molecole di soluto, spesso indesiderate (sono causa dei picchi scodati). Viene quindi spesso effettuato un processo di “end-capping” utilizzando un silano di piccole dimensioni che si lega ai silanoli liberi. Piccoli silani come il trimetilclorosilano sono in grado di accedere a molti dei silanoli liberi rimasti dopo il legame della fase stazionaria. Il processo di end- capping rende i silanoli inacessibili alle molecole di soluto. DISATTIVAZIONE DELLA SILICE (ENDCAPPING) Si O OH Si OH Si O OH Si O

60 FASE MOBILE IN CROMATOGRAFIA LIQUIDA In tutti i tipi di cromatografia liquida, tranne quella di esclusione dimensionale, la fase mobile gioca un ruolo fondamentale nella separazione. E’ possibile utilizzare un solvente singolo, tuttavia molto spesso è necessario utilizzare una miscela di due o più solventi per ottenere la fase mobile di composizione ottimale. Durante l’analisi è possibile effettuare un’eluizione isocratica (mantenendo costante la composizione della fase mobile) o un’eluizione in gradiente (la composizione della fase mobile varia durante l’analisi). L’eluizione in gradiente viene utilizzata quando la miscela di analiti comprende composti di caratteristiche molto diverse tra loro e serve per migliorare la separazione e ridurre i tempi di analisi.

61 SCELTA DELLA FASE MOBILE La scelta dei solventi da utilizzare per la fase mobile dipende dal tipo di cromatografia: nella cromatografia di adsorbimento/ripartizione la polarità dei solventi è il parametro più importante; nella cromatografia a scambio ionico sono importanti il pH e la forza ionica; nella cromatografia ad esclusione dimensionale deve essere considerata la solubilità degli analiti nella fase mobile ed il suo effetto sulle dimensioni e l’arrangiamento sterico delle molecole degli analiti.

62 Non tutti i solventi possono essere utilizzati in HPLC. Devono infatti possedere queste caratteristiche: devono essere miscelabili in diverse proporzioni non devono interagire chimicamente con gli analiti o gli altri solventi non devono alterare la risposta del rivelatore (ad es. assorbire significativamente all’UV) devono avere una bassa viscosità devono essere poco tossici e poco infiammabili devono essere non troppo costosi La fase mobile più comune in HPLC a fase inversa (RP-HPLC) è costituita da acqua miscelata con metanolo, acetonitrile, oppure tetraidrofurano (THF). SCELTA DELLA FASE MOBILE

63 LA COLONNA CROMATOGRAFICA Le dimensioni della colonna vengono scelte in modo da raggiungere il miglior compromesso in funzione di: capacità di carico, consumo di solventi, risoluzione desiderata e velocità dell’analisi. Le tipiche colonne cromatografiche analitiche sono lunghe 15-25 cm, hanno diametro interno di 2-5 mm e sono riempite con materiali a granulometria di 5-10 m. Le colonne più moderne (per cromatografia ad alta velocità) sono lunghe 3-5 cm e sono riempite con materiali di 3-5 m. Sono inoltre disponibili colonne microbore di lunghezza 25 cm, diametro interno di 1 mm e materiali di 10 m. Le colonne cromatografiche preparative sono lunghe almeno 25 cm ed hanno diametro interno di almeno 7.

64 SCELTA DELLA FASE STAZIONARIA

65 Tipi di matrici utilizzate Agarosio Agarosio E’ un polisaccaride derivante da particolari alghe rosse cosituito da residui alternati di D-galattoso e 3,6-anidro-L-galattoso. Disponibile commercialmente come Sepharose, Sepharose CL (cross-linking con 2,3-dibromopropanolo), Superose, Bio-Gel A. Limiti di esclusione 10- 40000 kD. Cellulosa Cellulosa Polimero di unita’ glucosidiche unito da legami  -1,4. Tramite epicloridrina vengono ottenuti i legami crociati essenziali per l’ utilizzo come matrice in cromatografia, il numero dei quali determina la dimensione dei pori. Destrano Destrano E’ un polimero di residui di glucosio uniti da legami  -1,6 prodotto dal batterio Leuconostoc mesenteroides. E’ presente in commercio con il nome di Sephadex. La porosita’ dei gel a base di destrano e’ controllata dalla massa molecolare del destrano usato e dall’ introduzione di legami crociati ottenuti con epicloridrina. Limiti di esclusione 0.7-800 kD. Il cosiddetto Sephacryl e’ destrano con legami crociati ottenuti con N,N’-metilene bisacrilamide. Limiti di esclusione 1-8000 kD. Il Superdex e’ un gel composito costituito da destrano covalentemente legato ad agarosio. Poliacrilamide Poliacrilamide E’ un polimero di acrilamide e N,N’-metilenbisacrilamide (quest’ultimo determina la formazione di legami crociati). E’ disponibile in commercio come Bio-GelP, con limiti di esclusione tra 0.2 e 400 kD. Polistirene Polistirene E’ un polimero di stirene legato con divinilbenzene. Silice Silice E’ un polimero prodotto a partire dall’ acido ortosilicico. I molti gruppi silanolo (Si-OH) rendono la matrice altamente idrofilica. Il loro eccesso puo’ essere eliminato derivatizzando con triclorometilsilano.

66 New Technology Monolithic Silica Columns

67 Traditional Silica "Particle-Based" Column Individual silica particles High flow resistance: Limits ability to shorten run times High backpressure: Reduces life of pumps, seals, and column Reduced throughput: Long run times Bed splitting and voiding possible: Shortens column life and affects reproducibility, lowers efficiency Onyx™ “Monolithic” Column Monolithic porous silica rod High flow rates: Due to high porosity Low backpressures: Less stress on system and column Increased throughput: Significantly shorter run times No inlet bed settling: Increased reliability, reproducibility, and lifetime, maintains efficiency

68 MULTI-DIMENSIONAL SEPARATIONS: AN ALTERNATIVE TO 2-D PAGE In multidimensional chromatography two (or more) techniques with “orthogonal” properties are combined to achieve higher separation power. FIRST DIMENSION: e.g. Size Exclusion, Ion-Exchange SECOND DIMENSION: e.g. Reversed Phase Ion-Exchange MS

69 Function Separation of volatile organic compounds Volatile – when heated, VOCs undergo a phase transition into intact gas-phase species Separation occurs as a result of unique equilibria established between the solutes and the stationary phase (the GC column) An inert carrier gas carries the solutes through the column

70 Components Carrier Gas, N 2 or He, 1-2 mL/min Injector Oven Column Detector

71 Sample Introduction (continued): –A sample can be introduced in several ways, the most common being with a direct insertion probe or by infusion through a capillary column. Samples are often introduced using a direct insertion probe or a capillary column. The probe and capillary carry the sample into the vacuum of the mass spectrometer. Once inside the mass spectrometer, the sample is exposed to the ionization source

72 Gas tank Oven Column Injector Syringe Detector

73 Injector A GC syringe penetrates a septum to inject sample into the vaporization camber Instant vaporization of the sample, 280  C Carrier gas transports the sample into the head of the column Purge valve controls the fraction of sample that enters the column

74 Splitless (100:90) vs. Split (100:1) Injector Syringe Injector Syringe Purge valve open Purge valve closed GC column He

75 Split or splitless Usually operated in split mode unless sample limited Chromatographic resolution depends upon the width of the sample plug In splitless mode the purge valve is close for 30- 60 s, which means the sample plug is 30-60 seconds As we will see, refocusing to a more narrow sample plug is possible with temperature programming

76 0.32 mm ID Liquid Stationary phase Mobile phase (Helium) flowing at 1 mL/min Open Tubular Capillary Column 15-60 m in length 0.1-5  m

77 Oven Programmable Isothermal- run at one constant temperature Temperature programming - Start at low temperature and gradually ramp to higher temperature –More constant peak width –Better sensitivity for components that are retained longer –Much better chromatographic resolution –Peak refocusing at head of column

78 Typical Temperature Program Time (min) 0 60 50  C 220  C 160  C

79 GAS CROMATOGRAFIA (GC)

80 RIVELATORI PER GC

81 GC-MS Kopplung GC