1 Biocatalizzatori e loro applicazioni nelle bio- trasformazioni.

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1 1 Biocatalizzatori e loro applicazioni nelle bio- trasformazioni.

2 2. biotrasformazione reazione accelerata da catalizzatori biologici = i biocatalizzatori a) Enzimi isolati b) Cellule intere.

3 Che cosa sono gli Enzimi ?

4 Le proteine Figura 3.11 FUNZIONI MONOMERI STRUTTURE

5 Funzioni delle proteine

6 20 tipi diversi di amminoacidi Essenziali Non essenziali Amminoacidi essenziali Granoturco e altri cereali Metionina Valina (Istidina) Treonina Fenilalanina Isoleucina Lisina Fagioli e altri legumi Leucina Triptofano MONOMERI

7 Ogni amminoacido contiene: –un gruppo amminico; –un gruppo carbossilico; –un gruppo R, la regione variabile che determina le proprietà specifiche di ciascuno dei 20 diversi amminoacidi. H H N H C R C O OH Gruppo amminico Gruppo (acido) carbossilico Figura 3.12A

8 Ogni amminoacido ha proprietà specifiche basate sulla propria struttura: H H N H C CH 2 CH CH 3 C O OH H H NC H CH 2 OH C O H H NC H C O CH 2 C OHO Leucina (Leu)Serina (Ser)Acido aspartico (Asp) IdrofobicoIdrofilico Figura 3.12B

9 STRUTTURE

10 Condensazione  legami covalenti detti legami peptidici. H H NCC O OH H H N+C H R C O H2OH2O H H NCCNC C R HR O Legame peptidico Dipeptide Amminoacido Reazione di condensazione Gruppo amminico H R Amminoacido Gruppo carbossilico HO H Figura 3.13 STRUTTURA PRIMARIA

11 Struttura primaria Gly Thr Gly Glu SerLys Cys Pro LeuMet Val Lys Val Leu Asp AlaVal Arg Gly Ser Pro Ala Ile Asn Val Ala Val His Val Amminoacidi Phe Arg

12 determina configurazione specifica determina la sua funzione STRUTTURA SECONDARIA Struttura secondaria C N O C C N H O C C H Legame idrogeno O C N H C C O N H O C C N H C N O C C N H O C C N H C O C H N H C O H C R H N Alfa elica C N H C C H H O N R C C O N H O C C N H C C O N H O C C N H C O C N H O C C N H C O O C C N H C C O N H C C O N H C C O N H C C O N H C C O N H C C O N H C C O H N C Foglietto ripiegato alfa elica Beta foglietto ripiegato

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16 struttura terziaria Polipeptide (singola unità di transtiretina) di una proteina è l’aspetto generale e tridimensionale di un polipeptide. è dovuta ai legami a idrogeno e ionici che si formano tra alcuni dei gruppi R polari e alle interazioni tra gruppi R idrofobici del polipeptide e l’acqua.

17 struttura quaternaria Transtiretina, con quattro subunità polipeptidiche identiche Catena polipeptidica Collagene due o più catene polipeptidiche

18 Scanalatura determina configurazione specifica determina la sua funzione

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20 ENZIMI

21 Energia potenziale delle molecole Reagenti Energia assorbita Prodotti Quantità di energia assorbita Reagenti Energia liberata Prodotti Quantità di energia liberata Energia potenziale delle molecole

22 Barriera E A Reagenti Prodotti Enzima Contenitore 1Contenitore 2 energia di attivazione (E A ).

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24 Enzima (saccarasi) Glucosio Fruttosio Sito attivo Substrato (saccarosio) H2OH2O 1 Enzima disponibile con il sito attivo vuoto 2 Il substrato si lega all’enzima che subisce un adattamento indotto 4 I prodotti vengono liberati 3 Il substrato si scinde nei prodotti Esempio di reazione catalizzata da un enzima: http://www.youtube.com/watch?v=zFWsSjA4R58

25 25 Gli Enzimi spesso sono inattivi senza la pre- senza di altre particelle dette Coenzimi (NAD +, FAD, ATP, CoASH ), Cofattori  ioni metallici Gruppi prostetici  leg cov.

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29 http://www.youtube.com/watch?v=PILzvT3spCQ INIBITORI

30 –Gli inibitori competitivi occupano il sito attivo di un substrato. –Gli inibitori non competitivi cambiano la funzione dell’enzima modificando la sua forma. Substrato Enzima Sito attivo Legame normale del substrato Inibitore enzimatico Inibitore non competitivo Inibitore competitivo

31 Dimensioni e PM E< S Siti catalitici o Siti attivi  apolari > Parte di AA non in contatto con S, ma x orientamento enzima – substrato

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33 33 dimensioni della molecola enzimatica ( E ) sono normalmente superiori a quelle della molecola del substrato ( S ). L' Enzima ha in media un peso molecolare di alcune migliaia di Dalton, mentre quello del Substrato è dell' ordine di alcune centinaia.

34 34 Tale rapporto dimensionale lascia intuire che solo alcune regioni dell' enzima sono direttamente interessate all' attività cataliti- ca: queste regioni, dette Siti catalitici o Siti attivi, sono quasi sempre una sorta di tasca della superficie della proteina en- zimatica.

35 35 I residui amminoacidici presenti, sporgenti all' interno del sito attivo, sono prevalente- memente apolari; in questo modo si crea- no le premesse per l' espulsione della mag- gior parte delle molecole d' acqua dalla cavità, in modo da consentire una maggior concentrazione del substrato nel sito attivo.

36 36 In conclusione la maggior parte degli amminoacidi degli enzimi non entrano in contatto con il substrato; essi tuttavia hanno un ruolo importantissimo: costitui- scono l' impalcatura adatta per favorire il reciproco orientamento enzima – substrato, tanto necessario per garantire una buona catalisi.

37 37. Il riconoscimento substrato - sito attivo è altamente specifico.

38 38 Il modello interpretativo più semplice dell' interazione fra Enzima e Substrato inizia con il legame tra lo stesso Enzima ed il substrato formando un complesso intermedio, che poi si trasformerà nel Prodotto lasciando l' Enzima libero, pronto per un nuovo atto catalitico : ES E + P E + S

39 39 Modello di Fischer detto a chiave - serratura.

40 40 Per quanto riguarda il meccanismo, secondo cui puo' realizzarsi l' inserimento del substrato nel sito è stato formulato il Modello di Fischer detto a chiave - serratura. L' Enzima ha una configurazione rigida già perfettamente complementare a quella del substrato; il riconoscimento vicendevole è quindi altamente specifico.

41 Velocità di reazione dipende Concentrazione del Substrato Concentrazione dell' Enzima pH dell'ambiente di reazione T dell'ambiente di reazione

42 Legge di Michaelis-Menten velocità iniziale v 0 = pendenza della tangente alla curva di avanzamento della reazione al tempo zero t 0 al tempo t 1 il prodotto si accumula con velocità sempre minori perché il substrato si consuma Leonor Michaelis (1875-1949) Medico-biochimico tedesco Maud Menten (1879-1960) Medico canadese

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46 46 La velocità delle reazioni enzimatiche è influenzata da molti fattori. Infatti l' azione catalitica di una proteina enzimatica consiste nel selezionare, tra i diversi percorsi possibili, quello che ri- chiede minore energia di attivazione.

47 47 In tal modo si ha un maggior numero di molecole trasformate nell' unità di tempo e cio' si traduce in un aumento della velocità di reazione. Tale velocità dipende anche da numerosi parametri chimico- fisici, come : Concentrazione del Substrato e del- l' Enzima, pH dell'ambiente di reazione.

48 LEGGE DI MICHAELIS-MENTEN Cinetica enzimatica

49 Enzima  proteina in grado di catalizzare una reazione chimica 1interazione tra substrato (molecole che partecipano alla reazione) e sito attivo (parte di enzima in cui avvengono le reazioni) 2formazione del complesso enzima-substrato 3formazione del prodotto, allontanato dall’enzima che resta libero di iniziare una nuova reazione

50 Importanza della cinetica enzimatica Informazioni indirette su: meccanismo di reazione specificità enzimatica parametri che caratterizzano proprietà fisiche degli enzimi Legge di Michaelis-Menten descrive la dipendenza iperbolica velocità enzimatica vs.. concentrazione del substrato introduce un parametro cinetico K m, costante di Michaelis-Menten importante per: –caratterizzare l’interazione enzima-substrato –valutare la specificità enzimatica –modificare la velocità di un’intera via metabolica

51 Legge di Michaelis-Menten velocità iniziale v 0 = pendenza della tangente alla curva di avanzamento della reazione al tempo zero t 0 al tempo t 1 il prodotto si accumula con velocità sempre minori perché il substrato si consuma Leonor Michaelis (1875-1949) Medico-biochimico tedesco Maud Menten (1879-1960) Medico canadese

52 Legge di Michaelis-Menten 1° : enzima, substrato e complesso in equilibrio Le reazioni enzimatiche procedono in due stadi costante di dissociazione del complesso ES poiché [E]<<[S], v è proporzionale a [E] T = [E]+[ES] : E + SESE + P KSKS k cat

53 Legge di Michaelis-Menten 2° : ipotesi dello stato stazionario se k -1 >> k 2 –l’equilibrio è raggiunto prima della formazione del prodotto se k 2  k -1 –[E] T < [S] –[ES] raggiunge subito uno stato stazionario K m : costante di Michaelis-Menten

54 Legge di Michaelis-Menten 2° : ipotesi dello stato stazionario Per qualunque reazione enzimatica [E] T, k 2, K m sono costanti se [S]<<K m :reazione circa del 1° ordine se [S]>>K m :reazione di ordine zero rispetto ad S poiché [E] T e k 2 sono costanti si definisce velocità massima di reazione se [S] = K m :enzima semisaturo –se [E] è espressa in moli di siti attivi/litro, k 2 (espresso in t -1 ) rappresenta il n° di turnover dell’enzima, ovvero il n° molecole di S trasformate in P nel tempo quando l’enzima opera al massimo dell’efficienza

55 Legge di Michaelis-Menten 3° : formazione di un intermedio ES’ con legame covalente Reazioni enzimatiche a più substrati –per lo stato stazionario: essendo risolvendo rispetto as ES, si ottiene E + SESES’ E + P KSKS k2k2 k3k3 X k cat KmKm

56 56 Classificazioni degli Enzimi

57 57 Vantaggi e svantaggi delle biotrasformazioni - Elevata selettività ( chemo-, regio-, stereoselet- tività ) ; - Condizioni blande ed ecologicamente compa- tibili ; - Possibilità di classificare come naturali i pro- dotti di biotrasformazioni di substrati naturali.

58 58 Gli svantaggi spesso evocati come princi- pali limiti all' impiego di biotrasformazioni sono: - Bassa stabilità di molti biocatalizzatori nelle condizioni di operazione; - Basse rese; - Basso numero di biocatalizzatori disponibili commercialmente.

59 59 La selettività, la stabilità e l' attività di molti biocatalizzatori nelle condizioni di reazione desiderate possono essere migliorate attraverso diverse tecniche : - selezione di nuovi enzimi con tecniche di screening innovative ;

60 60 - immobilizzazione ; - ricerca delle migliori condizioni di reazione ( ingegneria di reazione );. Applicazioni La produzione di molecole come singoli enantiomeri è di importanza sempre crescente non solo nel settore farmaceutico, ma anche in quelli della chimica agroalimentare.

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62 62 - E' quindi necessario avere a disposizione metodi stereoselettivi semplici che permettano l' ottenimento di molecole enantiopure anche in quantità limitate. - Gli Enzimi sono catalizzatori chirali prodotti in forma stereochimicamente pura e, come

63 63 tali, sono in grado di catalizzare la trasfor- mazione di un singolo enantiomero di una miscela racemica, oppure di indurre asimmetria in reazioni che generano un centro stereoge- nico, come si puo' notare nell' immagine suc- cessiva :

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65 65 - Ingegneria di reazione Una volta ottenuto il biocatalizzatore adatto alla trasformazione richiesta, è necessario ricercare le condizioni di reazioni ideali per ottenere la massima attività del biocataliz- zatore e, nel contempo, favorire la Termodina- mica della reazione nel senso desiderato.

66 66. L' equilibrio della reazione biocatalizzata puo' essere spostato verso il prodotto desi- derato, giocando su diversi parametri come:. La concentrazione di prodotti/ substrati, pH, temperatura, forza ionica, solubilità dei pro- dotti/ substrati.

67 67 Un esempio riguarda l' impiego di Enzimi ( soprattutto Idrolasi ) in condizioni di bassa concentrazione e/o attività d' acqua; questa situazione è facilmente ottenibile uti- lizzando il biocatalizzatore in solventi orga- nici quasi anidridi. Come si vede dalla figura successiva le

68 68 idrolasi catalizzano la rottura di vari legami attraverso l' intervento di acqua mediante una reazione di Equilibrio. Tuttavia il catalizzatore puo' promuovere an- che la reazione opposta, ovvero la Condensazione con eliminazione d' acqua.

69 69 In condizioni in cui prevale un eccesso del mezzo acquoso l' equilibrio è spostato

70 70 verso l' Idrolisi per azione di massa. In condizioni di bassa attività di acqua, prevale la Condensazione ( ad esempio la sintesi di Esteri, ammidi, ecc. ). Per queste ragio- ni, sono state cercate Idrolasi stabili e attive in solventi organici. Un altro interessante esempio per favorire

71 71 termodinamicamente l' equilibrio chimico verso il prodotto desiderato consiste nel far precipitare il medesimo prodotto me- diante un composto coprecipitante, sottraen- dolo all' equilibrio stesso e spostando la reazione verso destra.

72 72 La selettivita' e la resa della reazione possono essere limitate quando vengono uti- lizzate cellule intere come biocatalizzatori, che aumentano la presenza di numerosi Enzimi, catalizzando ulteriormente la trasformazione del prodotto desiderato. Questi inconvenienti possono essere risolti utilizzando sul catalizzatore tecniche di In- gegneria genetica.