CREAZIONE DI ANIMALI TRANSGENICI 1) Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile di una cellula uovo appena fecondata. Se l’inserimento.

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1 CREAZIONE DI ANIMALI TRANSGENICI 1) Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile di una cellula uovo appena fecondata. Se l’inserimento genico riesce, tutto l’animale che ne deriva è trangenico (comprese cellule germinali) 2) Trasferimento nucleare di cellula somatica con transgene in oocita fecondato privo di nucleo e reimpianto in madre surrogata. Tutto l’animale che ne deriva è trangenico 3)Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in blastocisti di madre surrogata L’animale che ne deriva è chimerico (produrrà transgenici solo se le sue cellule germinali contengono il transgene) A monte del gene da esprimere sempre inserito un promotore, a volte con specificità tissutali

2 Tecnologia del trasferimento nucleare Riprogrammazione del nucleo che ripercorrerà l’intero sviluppo

3 Clonazione animale: la creazione di Dolly Tecnologia del trasferimento nucleare

4 Dolly, primo esperimento riuscito di clonazione animale (1997) Problematiche della clonazione animale: - Alta inefficienza dei metodi di trasferimento nucleare - Alta frequenza di malattie congenite negli animali - Invecchiamento prematuro degli animali - Considerazioni etiche del pharming soprattutto nelle piante (OGM). Tecnologia del trasferimento nucleare

5 Problematiche della clonazione animale Differenze dovute a fattori epigenetici e ambientali: colore del mantello, personalità. Studi con microarray di espressione su tessuti di animali e loro cloni: centinaia di geni con espressione anormale. La riprogrammazione del nucleo determina alta non vitalità dei cloni o forte alterazione dell’espressione genica

6 TRANSGENESI IN M. musculus Creazione di animali geneticamente modificati per: - conferma di gene candidato responsabile di una patologia umana - studio della funzione e della regolazione di un gene - modelli animali per lo studio delle malattie umane - modelli animali sperimentali: per la correzione del difetto genetico (“rescue” fenotipico), per messa a punto terapia farmacologica Un organismo si considera transgenico quando il gene esterno è: integrato nel suo genoma; espresso correttamente e selettivamente in uno o più tessuti dell'animale; integrato nella linea germinale e quindi trasmissibile dall’animale fondatore alla progenie.

7 METODI DI TRASFERIMENTO GENICO 3) Metodi: - Microiniezione nel pronucleo maschile in oocita fecondato - Trasferimento nucleare di cellula con transgene in oocita fecondato privo di nucleo e reimpianto in madre surrogata. - Trasferimento genico in cellule Embrionali Staminali (ES) e reimpianto in blastocisti 4) Tipi di inserzione: - ectopica (influenza di elementi di regolazione endogeni, influenza struttura cromatina) - mirata (inserimento in una posizione occupata da sequenza omologa) 5) Possibile controllo dell’espressione genica: geni inseriti a valle di promotori inducibili o tessuto-specifici 1) Trasferimento genico diretto: trasfezione DNA libero con microiniezione 2) Trasferimento tramite vettori: infezione virale (adenovirus, virus adeno- associati, retrovirus) TRANSGENESI IN M. musculus

8 KNOCK IN Introduzione di sequenza genica (può appartenere alla stessa specie o può derivare da specie differenti) da esprimere nel topo. - Aumento del numero di copie gene endogeno studio della sovraespressione - Inserimento di un intero gene esogeno o solo alcuni esoni può contemporaneamente determinare l’inattivazione del gene endogeno KNOCK OUT Introduzione di sequenza genica per l’abolizione della funzione genica endogena - Inattivazione genica costitutiva - Inattivazione genica condizionale ESPRESSIONE INDUCIBILE DI UN TRANSGENE Attivazione o inattivazione genica: mutante condizionale

9 Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile e integrazione di copie di DNA libero (accoppiata con maschio vasectomizzato) Inserzione ectopica

10 DNA esogeno DNA genomico Produzione di organismo Knock-in o Knock-out per ricombinazione omologa con gene endogeno Inserzione mirata

11 Produzione di organismo Knock-out per ricombinazione omologa con gene endogeno

12 Produzione di organismo Knock-out per ricombinazione omologa con gene endogeno Inserzione mirata

13 Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in blastocisti Le cellule staminali embrionali derivano dalla massa di cellule interne della blastocisti, 3,5 - 4,5 giorni dopo l’accoppiamento. Possono essere mantenute in coltura con fattori che impediscono il differenziamento: totipotenti Cellule staminali pluripotenti isolate anche da feto e adulto (numero e capacità differenziative limitati)

14 Il topo è una chimera Zigote Mutazione genetica in due popolazioni cellulari Mosaico una delle cellule differiscono per una mutazione Zigote 1(blastocisti) due popolazioni cellulari Chimera Zigote 2 (cellula ES transgenica) con genotipo diverso Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in blastocisti

15 Solo alcuni topi avranno cellule germinali transgeniche e produrranno gameti da cui deriveranno topi transgenici Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in blastocisti

16 Mutagenesi di ES con inserzione mirata per produzione topo KO Si controlla il corretto inserimento attraverso la metodica della selezione positiva- negativa con G418 e ganciclovir Vettore con: gene tk (timidino-chinasi) (tk+) dell’Herpes virus (tk HSV), gene della Neomicina resistenza = neo R Gene endogeno inattivato per inserzione mirata del gene neo R Tk = pathway di recupero dei nucleotidi: converte la timidina libera in monofosfato per la sintesi DNA

17 G418: analogo della neomicina Ganciclovir (Gcv) è un analogo del nucleoside erpetico: uccide le cellule tk +, ovvero con inserzione ectopica del vettore virale Selezione positiva-negativa con G418 e ganciclovir Gcv Gcv-P Gcv-PPP Incorporazione DNA Terminazione catena con rottura del DNA Tk HSV Tk mammifero

18 Selezione positiva-negativa con G418 e ganciclovir Cellule ES con mutazione impiantate in blastociti di madre surrogata

19 Mutagenesi di ES con inserzione mirata per produzione topo ko Cellule ES con mutazione impiantate in blastociti di madre surrogata

20 Produzione di topo ko (in omozigosi) successiva a inserzione mirata in un gene endogeno Aguti Fenotipo ko = Coda arricciata I topi interamente neri (a/a M/M) sono esclusi Genotipizzazione

21 1)Microiniezione di vettore ricombinante in nucleo cellule ES di topo marrone 2)Selezione con G418 e gancyclovir di ES che hanno avuto ricombinazione omologa e inattivazione del gene 3) Inserimento delle cellule ES transgeniche in una blastocisti di topo mantello nero e impianto in una madre pseudogravida (mantello nero) 4) Selezione progenie chimerica 5) Individuazione genotipi eterozigoti 6) Incrocio di eterozigoti per ottenere topo omozigote knock-out CREAZIONE TOPO KnockOut

22 Topi transgenici Topo nero: apparentemente nessun contributo di cellule ES Topo fondatore chimerico: forte contributo delle cellule ES Topo fondatore chimerico: debole contributo delle cellule ES

23 TRANSGENESI IN M. musculus Controllo di espressione del transgene Uso di promotori costitutivi (es: promotore + enhancer di SV40, sequenze riconosciute in diversi tipi cellulari) per ottenere geni sempre attivi e molto espressi Uso di promotori inducibili specifici per tipo cellulare o stadio di sviluppo Uso di proteine di fusione rilevabili facilmente (es: gene fuso con cDNA proteina GFP). Gene da esprimere fuso con peptidi target di anticorpi fluorescenti.

24 Terapia genica della linea germinale: esempio di applicazione nel topo nano (little, lit/lit) Promotore MP di topo attivato da alte concentrazioni di zinco e cadmio nella dieta Topo nano Ereditato come Autosomico Dominante Uovo fecondato di topolina nana Dieta con cadmio e zinco È il doppio del nano

25 Studio dell’espressione genica di Evc murino Produzione di organismo Knock-in per ricombinazione e sostituzione di un gene cromosomico con un transgene Inserzione del gene LacZ sotto controllo trascrizionale degli elementi regolativi del gene Evc. SI STUDIANO DUE ASPETTI: - CONSEGUENZE INATTIVAZIONE - NORMALE PATTERN DI ESPRESSIONE TISSUTALE Sindrome Ellis van Creveld (AR): acondroplasia associata con alterazioni dello sviluppo della cute, dei capelli e dei denti, polidattilia e con difetti del setto cardiaco Embrione Evc +/- Forte espressione nelle regioni della bocca Creazione omozigoti Evc -/-

26 Produzione di topo knock out ed analisi fenotipica Arti corti e anomalie scheletriche osso cartilagine Anomalie nella dentizione

27 I topi sono sempre un buon modello? Differenze nelle vie biochimiche Differenze nei percorsi di sviluppo Durata della vita media (esordio tardivo nell’uomo) Differenze nel contesto genetico

28 ESEMPI DI MODELLI MURINI DI PATOLOGIE UMANE OTTENUTI CON METODI TRANSGENETICI MalattiaGeneMetodo Fibrosi cisticaCFTRInattivazione da inserzione mirata Beta talassemiaBeta globinaInattivazione da inserzione mirata Malattia di GaucherGBAInattivazione da inserzione mirata Sindrome dell’X fragile FMR1Inattivazione da inserzione mirata Sindrome da prioni umana PRNPIntegrazione del gene murino mutante della proteina prionica Atassia spinocerebellare I SCA1 (atassina)Integrazione del gene umano espanso

29 I topi sono sempre un buon modello? Mutazioni spontanee in topi, patologie spesso diverse dalle umane Topo NOD: diabetico ma senza obesità. Assomiglia al diabete insulino- dipendente umano Topo mdx: mutazione nonsenso nel gene mdx, distrofia molto più lieve della DMD Modelli per malattie con perdita di funzione: identificazione ortologo e creazione topo knock-out. Produzione di: alleli nulli (assenza completa di funzione), mutazioni leaky, (inattivazione geni con funzione simile) Differenza nel fenotipo possibile per presenza di geni modificatori in differenti ceppi murini Modelli per malattie umane con acquisto di funzione: topo knock-in (es inserimento di oncogeni, geni con triplette espanse)

30 Meno del 5% della prole è transgenica Efficienza del trasferimento genico Problematiche: - Alta inefficienza dei metodi di trasferimento nucleare o microiniezione nei pronuclei. - Clonazione animale: alta frequenza di malattie congenite negli animali - Invecchiamento prematuro degli animali - Considerazioni etiche del pharming soprattutto nelle piante (OGM).

31 Animali come organismi modello