Il cancro è una malattia genetica Deriva da alterazioni della sequenza del DNA Deriva da alterazioni della sequenza del DNA Mutazioni somatiche Mutazioni.

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1 Il cancro è una malattia genetica Deriva da alterazioni della sequenza del DNA Deriva da alterazioni della sequenza del DNA Mutazioni somatiche Mutazioni somatiche Mutazioni che non vengono trasmesse alla generazione successiva e che non possono essere perciò ereditate Mutazioni che non vengono trasmesse alla generazione successiva e che non possono essere perciò ereditate Tali mutazioni vengono trasmesse alle cellule figlie dopo la divisione cellulare Tali mutazioni vengono trasmesse alle cellule figlie dopo la divisione cellulare

2 Il cancro è una patologia monoclonale Tutte le cellule neoplastiche di un individuo originano da una singola cellula progenitrice Tutte le cellule neoplastiche di un individuo originano da una singola cellula progenitrice La cellula clonale tumorale esposta ad un agente mutageno subisce un danno irreversibile al DNA La cellula clonale tumorale esposta ad un agente mutageno subisce un danno irreversibile al DNA Lo sviluppo del tumore è un processo che avviene in diverse fasi Lo sviluppo del tumore è un processo che avviene in diverse fasi

3 COME SI SVILUPPA IL CANCRO Lo sviluppo dei tumori nell’uomo è il risultato di una complessa interazione tra: Fattori geneticiFattori ambientali Sono necessarie diverse mutazioni in geni diversi per la trasformazione neoplastica della cellula

4 Vie cellulari alterate dal cancro Tre sono i processi importanti che regolano il numero globale delle cellule di un individuo: Tre sono i processi importanti che regolano il numero globale delle cellule di un individuo: La divisione cellulare La divisione cellulare La morte cellulare La morte cellulare Il differenziamento Il differenziamento

5 Tre tipi di geni Esistono tre tipi principali di geni mutati che contribuiscono allo sviluppo di un tumore Esistono tre tipi principali di geni mutati che contribuiscono allo sviluppo di un tumore Oncogeni Oncogeni Geni oncosoppressori Geni oncosoppressori Geni coinvolti nel riparo del DNA Geni coinvolti nel riparo del DNA

6 Oncogeni Scoperti nei virus trasformanti ad RNA Scoperti nei virus trasformanti ad RNA Il nome deriva dal virus in cui sono stati identificati: e.g. ras da Rous Sarcoma Virus Il nome deriva dal virus in cui sono stati identificati: e.g. ras da Rous Sarcoma Virus Controparti cellulari normali: proto-oncogeni che stimolano crescita e divisioni cellulari Controparti cellulari normali: proto-oncogeni che stimolano crescita e divisioni cellulari Oncogeni: geni che controllano positivamente la proliferazione cellulare Proto-oncogeni Oncogeni

7 Mutazione per acquisizione di funzione Mutazione per acquisizione di funzione

8 Ruolo degli oncogeni Ruolo normale: stimolazione crescita e proliferazione cellulare Ruolo normale: stimolazione crescita e proliferazione cellulare Mutazione > Aumento della funzione > trasformazione, invasività Mutazione > Aumento della funzione > trasformazione, invasività

9 Funzioni dei protoncogeni: stimolazione della crescita Fattori di crescita secreti Fattori di crescita secreti Recettori di superficie cellulare Recettori di superficie cellulare Fattori intracellulari di trasduzione del segnale Fattori intracellulari di trasduzione del segnale Proteine nucleari che legano il DNA Proteine nucleari che legano il DNA

10 Mutazioni Mutazioni puntiformi Mutazioni puntiformi Traslocazioni cromosomiche Traslocazioni cromosomiche

11 Mutazione puntiforme Oncogene ras (carcinoma della vescica) sul cromosoma 12 Oncogene ras (carcinoma della vescica) sul cromosoma 12 Mutazione puntiforme: Gly12Val Mutazione puntiforme: Gly12Val Blocco della conversione di ras dalla forma attiva, legata al GTP, alla forma inattiva, legata al GDP, che deregola la crescita cellulare Blocco della conversione di ras dalla forma attiva, legata al GTP, alla forma inattiva, legata al GDP, che deregola la crescita cellulare

12 Ras signaling pathway

13 Traslocazione cromosomica: CML t(9;22)(q34;q11)

14 t(9;22)(q34;q11) 9q34: abl (abelson virus) proto- oncogene 9q34: abl (abelson virus) proto- oncogene 22q11: bcr (breakage cluster region) 22q11: bcr (breakage cluster region) Fusione bcr-abl sul cromosoma 22 (cromosoma Philadelphia) Fusione bcr-abl sul cromosoma 22 (cromosoma Philadelphia)

15 Oncogeni Mutazioni negli oncogeni sono di solito acquisite Mutazioni negli oncogeni sono di solito acquisite Mutazioni dominanti: una sola copia genica mutata è sufficiente a produrre il cancro per acquisizione di funzione - “gain of function” Mutazioni dominanti: una sola copia genica mutata è sufficiente a produrre il cancro per acquisizione di funzione - “gain of function”

16 Tumor-suppressor genes Oncosoppressori Controllo negativo della proliferazione cellulare Controllo negativo della proliferazione cellulare – Prevenzione di crescita cellulare abnorme – Normalmente inibiscono la crescita e la divisione cellulare – PRb: protoncogene presente su 13q14

17 Tumour suppressor genes Retinoblastoma (Rb): bilaterale nel 30% dei casi Retinoblastoma (Rb): bilaterale nel 30% dei casi Questo tumore può esistere sia in forma ereditaria che in forma sporadica Questo tumore può esistere sia in forma ereditaria che in forma sporadica

18 Nella forma familiare della malattia, una mutazione germinale del gene Rb è trasmessa al bambino ed è presente in tutte le cellule. Nella forma familiare della malattia, una mutazione germinale del gene Rb è trasmessa al bambino ed è presente in tutte le cellule. Una seconda mutazione viene acquisita in un particolare retinoblasto che dà origine ad un tumore della retina. Una seconda mutazione viene acquisita in un particolare retinoblasto che dà origine ad un tumore della retina. La trasmissione ereditaria di un gene mutato aumenta di molto la prpbabilità che possa avvenire una seconda mutazione La trasmissione ereditaria di un gene mutato aumenta di molto la prpbabilità che possa avvenire una seconda mutazione

19 Nella forma sporadica entrambe le mutazioni avvengono a livello somatico nello stesso retinoblasto. Nella forma sporadica entrambe le mutazioni avvengono a livello somatico nello stesso retinoblasto. Questo è un evento abbastanza raro ecco perchè i casi sporadici di solito colpiscono soltanto un occhio rispetto ai casi familiari Questo è un evento abbastanza raro ecco perchè i casi sporadici di solito colpiscono soltanto un occhio rispetto ai casi familiari

20 Ipotesi dei due colpi 1971: Knudson’s two-hit hypothesis (ipotesi del doppio colpo) 1971: Knudson’s two-hit hypothesis (ipotesi del doppio colpo) Casi familiari di Rb: Casi familiari di Rb: – 1° mutazione germinale (inattivazione di un allele) – 2° mutazione somatica (perdita del secondo allele) Casi sporadici: 2 mutazioni somatiche nella stessa cellula Casi sporadici: 2 mutazioni somatiche nella stessa cellula

21 Ereditarietà degli oncosoppressori La maggior parte dei tumori ereditari sono dovuti all’ereditarietà di un gene oncosoppressore mutato (first hit) La maggior parte dei tumori ereditari sono dovuti all’ereditarietà di un gene oncosoppressore mutato (first hit) Ma è necessario un secondo colpo (second hit) per lo sviluppo del tumore, pertanto il gene agisce in modo recessivo a livello cellulare Ma è necessario un secondo colpo (second hit) per lo sviluppo del tumore, pertanto il gene agisce in modo recessivo a livello cellulare L’ereditarietà degli oncogeni è di tipo dominante L’ereditarietà degli oncogeni è di tipo dominante in quanto basta che sia mutata una copia del gene affinchè compaia il tumore. Nel caso degli oncosoppressori è necessario che entrambe le copie siano mutate.

22 Riparano i danni al DNARiparano i danni al DNA sono considerati un sottogruppo di Geni Oncosoppressorisono considerati un sottogruppo di Geni Oncosoppressori La perdita della loro funzione determina l’accumulo di mutazioni in altri geni crucialiLa perdita della loro funzione determina l’accumulo di mutazioni in altri geni cruciali Geni coinvolti nel DNA repair

23 Il gene p53 La più comune modificazione genetica associata a cancro La più comune modificazione genetica associata a cancro oncosoppressore, “guardiano del genoma” oncosoppressore, “guardiano del genoma” Espresso in grande quantità in cellule con danni al DNA Espresso in grande quantità in cellule con danni al DNA Coinvolto nella fase G1/S del ciclo cellulare (blocca la replicazione di cellule danneggiate) Coinvolto nella fase G1/S del ciclo cellulare (blocca la replicazione di cellule danneggiate) Coinvolto nell’apoptosi Coinvolto nell’apoptosi

24 BRCA1 e BRCA2 Proteine la cui espressione si modifica in caso di “risposta al danno del DNA” Proteine la cui espressione si modifica in caso di “risposta al danno del DNA” hanno attività di oncosoppressori hanno attività di oncosoppressori Responsabili dell’insorgenza del cancro della mammella Responsabili dell’insorgenza del cancro della mammella

25 PROTEINA APC E’ un tumor suppressor gene che controlla l'espressione di geni fondamentali nel processo di divisione cellulare Mutazioni della proteina APC determinano aumento della divisione cellulare Tumor suppressor gene nel cancro del colon retto

26 LEUCEMIE La leucemia è una malattia che deriva dalla proliferazione neoplastica di cellule emopoietiche La leucemia è una malattia che deriva dalla proliferazione neoplastica di cellule emopoietiche Le leucemie sono suddivise in due classi principali in base alla morfologia della linea cellulare da cui originano: Le leucemie sono suddivise in due classi principali in base alla morfologia della linea cellulare da cui originano: – Leucemia mieloide – Leucemia linfoide Inoltre la leucemia mieloide e linfoide vengono distinte in: Inoltre la leucemia mieloide e linfoide vengono distinte in: – croniche caratterizzate da cellule neoplastiche relativamente mature e più simili alle corrispondenti cellule normali. – acute caratterizzate da cellule neoplastiche più immature

27 Cellula Staminale Proeritroblasto Mieloblasto Linfoblasto Monoblasto Megacarioblasto Promielocita Megacariocita Rottura Piastrine Eritroblasto basofilo Eritroblasto policromatofilo Eritrocita Cellule Rosse del sangue Reticolocita Espulsione del nucleo Basofilo Eosinofilo Neutrofilo Linfocita Monocita Basofilo Eosinofilo Neutrofilo Eritroblasto ortocromatico Mielocita Granulociti Agranulociti Cellule Bianche del sangue Emopoiesi Meta- mielocita

28 EMOPOIESI EMOPOIESI ApoptosisApoptosis CFU-G Myelocyte Granulocyte Multipotent Stem cells BFU-E Erythroblast LTC-IC Erythrocyte CFU-M Monoblast Monocyte CFU-MKMegakaryocyte Platelets Proliferation Differentiation CFU-L Lymphocyte LEUCEMIE LINFOIDI LEUCEMIE MIELOIDI

29 Traslocazioni X t(9;22) in LMC t(15;17) in LMA t(9;22) in LLA t(4;11) in LLA 11q23 in LLA LMA Inv(16) in LMA Delezioni cromosomiali parziali 5q - in LMA 6, 13, 11q - in LLC Internal tandem duplication Duplicazioni in tandem nel gene FLT3 Mutazioni puntiformi..AGCTCGG.....AGTTCGG.. Attivazione RAS in LMA, LLA MECCANISMI DI LESIONE GENICA NEI TUMORI EMOPOIETICI Duplicazioni cromosomiali Trisomia 12 in LLC

30 MECCANISMI MOLECOLARI DI TRASFORMAZIONE NEOPLASTICA ApoptosiApoptosi DifferenziamentoDifferenziamento ProliferazioneProliferazione 1 2 3 4 5 Alterazione di geni che codificano: 1: fattori di crescita 2: recettori dei fattori di crescita 3: trasduttori del segnale 4: fattori di trascrizione 5: proteine regolatorie del ciclo cellulare

31 Leucemia Mieloide Cronica (LMC) n Incidenza : 1–2 per 100.000 n Mediana dell’età di insorgenza: 53 anni n Aumento di incidenza con l’età (30% dei pazienti ha più di 60 anni n Unica lesione genetica : Cromosoma philadelphia n Alla presentazione 50% diagnosticati attraverso analisi di laboratorio

32 Decorso Clinico: le fasi della LMC Fase Cronica Durata Mediana 5 - 6 anni Durata Mediana 5 - 6 anni Fase Accelerata Durata mediana 6–9 mesi Crisi blastica Sopravvivenza mediana 3–6 mesi Fase Avanzata

33 Cromosoma Philadelphia:Traslocazione t(9;22)

34 BCR Breakpoint cluster region gene Breakpoint cluster region gene Locus at 22q11 Locus at 22q11 Codifica per la proteina bcr, di 160-kDa Codifica per la proteina bcr, di 160-kDa  proteina attivatore di GTPase (GAP)

35 ABL Abelson’s murine leukemia viral oncogene homolog Abelson’s murine leukemia viral oncogene homolog Locus at 9q34 Locus at 9q34  è una prioteina con attività chinasica strettamente regolata dall’interazione sterica tra domini di SH1 con SH2 e SH3 e l’ATP

36 1.M-bcr 2. m-bcr 3. μ –bcr BCR-ABL In BCR sono state identificate 3 differenti breakpoint cluster regions In BCR sono state identificate 3 differenti breakpoint cluster regions M-bcr m-bcr μ-bcr

37 BCR-ABL In ABL, i breakpoints di solito cadono in un’ampia regione che parte a monte dell’esone 1b e finisce a valle dell’esone 1a. In ABL, i breakpoints di solito cadono in un’ampia regione che parte a monte dell’esone 1b e finisce a valle dell’esone 1a. Punti di rottura Il contributo di ABL all’mRNA ibrido è invariabile a causa dello splicing dell’esone 1 Il contributo di ABL all’mRNA ibrido è invariabile a causa dello splicing dell’esone 1 a2

38 La proteina di fusione Bcr-Abl ► b3a2 ► b2a2 ► e19a2 BCR ABL Tyrosine kinase  -BCR A2 MBCR B2B2 B3B3 m-BCR ► e1a2

39 BCR-ABL Tre diversi trascritti di fusione e1a2 b2a2 b3a2 e19a2 BCRABL  Contributo costante di ABL → Potere trasformante  Contributo variabile di BCR → Fenotipo della patologia ► p190 kD ► p210 kD ► p230 kD

40 BCR-ABL BCR incrementa l’attività kinasica di ABL BCR incrementa l’attività kinasica di ABL – Incremento della proliferazione – Riduzione dell’apoptosi – Riduzione della adesione delle cellule allo stroma midollare

41 Bcr-Abl tirosina-chinasi: la proteina ‘chimerica’ che causa la trasformazione neoplastica Y = Tirosina P = Fosfato Y Proteina Bcr-Abl Substrato fosforilato Substrato Effettore Y P P P P ATP

42 ATTIVAZIONE COSTITUTIVA DELLE VIE DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE Inibizione morte cellulare Incremento della migrazione dal midollo osseo Proliferazione incontrollata

43 ESEMPIO: PAZIENTE CON SOSPETTA LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA APPROCCIO DIAGNOSTICO ALLA LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA INDAGINI DI I°LIVELLO

44 LMC in fase cronica: presentazione clinica Asintomatica nel 50% dei casi Asintomatica nel 50% dei casi Sintomatologia clinica Sintomatologia clinica Astenia Astenia Febbricola Febbricola Perdita di peso/anoressia Perdita di peso/anoressia Obiettività clinica Obiettività clinica Splenomegalia (50% dei casi)

45 FASI CRONICA ACCELERATA BLASTICA LEUCOCITI (granulociti) 20000/ µ L BLASTI0 >10% 30% PIASTRINE O NORMALI Puntato midollare Sangue periferico:Emocromo DIAGNOSI DI LMC: ESAMI DI LABORATORIO Sangue periferico normale Sangue periferico LMC Valori di riferimento 4.500 a 11.000 per µL.

46 Richiesta esami Tipizzazione genetica leucemia mieloide cronica traslocazione t(9;22)

47 INDAGINI DI II LIVELLO Citogenetica Convenzionale Citogenetica Molecolare – Fluorescence in-situ hybridization (FISH) Genetica Molecolare – Diagnostica basata su PCR Qualitativa – Monitoraggio basato su PCR Quantitativa

48 CITOGENETICA CONVENZIONALE La citogenetica convenzionale è una tecnica che permette lo studio del numero e della struttura dei cromosomi (studio del cariotipo) I cromosomi vengono esaminati “bloccati” in metafase. Step: prelievo del campione (sangue midollare) allestimento delle colture cellulari bandeggio dei cromosomi

49 CITOGENETICA

50 Citogenetica convenzionale Limiti Riarrangiamenti cromosomici complessi Riarrangiamenti cromosomici complessi Cattiva morfologia cromosomica Cattiva morfologia cromosomica Basso indice mitotico delle cellule neoplastiche Basso indice mitotico delle cellule neoplastiche Bassa crescita o fallimento della coltura Bassa crescita o fallimento della coltura

51 INDAGINI DI II LIVELLO Citogenetica Convenzionale Citogenetica Molecolare – Fluorescence in-situ hybridization (FISH) Genetica Molecolare – Diagnostica basata su PCR Qualitativa – Monitoraggio basato su PCR Quantitativa

52 CITOGENETICA MOLECOLARE (FISH) La Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) è una tecnologia che utilizza sonde nucleotidiche marcate (DNA probes) per identificare specifiche regioni di un cromosoma ovvero determinate sequenze del DNA. Step: denaturazione del DNA incubazione sonda + DNA denaturato (“annealing”) rilevazione del segnale della sonda con microscopio a fluorescenza

53 FISH: tappe della metodica

54 Sonda BCR-ABL utilizzata per la Fish

55 FISH (fluorescence in situ hybridization)

56 Citogenetica Convenzionale Citogenetica Molecolare – Fluorescence in-situ hybridization (FISH) Genetica Molecolare – Diagnostica basata su PCR Qualitativa – Monitoraggio basato su PCR Quantitativa INDAGINI DI II LIVELLO

57 La proteina di fusione Bcr-Abl ► b3a2 ► b2a2 ► e19a2 BCR ABL Tyrosine kinase  -BCR A2 MBCR B2B2 B3B3 m-BCR ► e1a2 p210

58 METODOLOGIE D’INDAGINE: LA PCR BCR ABL

59 PCR qualitativa (t 9;22)

60 PCR qualitativa (t 9;22) CN 2 5 6 8 3 1 4 7 9 CP b3a2 b2a2 proteina p210

61 Controlli di qualità interni Controllo di integrità dell’RNA: amplificazione di un gene sempre espresso per validare la buona qualità dell’RNA del campione da analizzare. 3 1 4 7 9 2 5 6 8 CN CP Gene di controllo PBG 1 5 2 3 4 6 7

62 Controlli di qualità interni: controlli positivi Controllo positivo: amplificazione dell’mRNA della linea cellulare caratterizzata geneticamente dal gene di fusione d’interesse. K562 CP 2 5 6 3 1 4 7

63 Controlli di qualità interni:controli negativi Controlli negativi procedura: amplificazione dell’mRNA derivante da cellule mononucleate di soggetti non affetti (NAC:no amplification control). Controlli negativi PCR: amplificazione di un’aliquota di acqua distillata. NTC: (no template control). NTCNACNTC NAC CP CP Contaminazione dei campioni o dei reagenti

64 VARIABILI PRE-ANALITICHE VOLUME SANGUE: DX: 10 ML in EDTA SANGUE PERIFERICO F.UP: 20 mL in EDTA SANGUE PERIFERICO TEMPI DI CONSEGNA: in giornata/max entro le 24 ore

65  LMC è una malattia devastante con un prognosi terribile per molti pazienti  Fino a pochi anni fa le opzioni terapeutiche erano poche e il goal terapeutico rimaneva solo il ritardo della progressione di malattia 1950 e 1960 è il periodo degli agenti chemioterapici: aumento survival rate fino a 5 anni 1920 viene introdotto il primo trattamento per la LMC con scarsi risultati: Radiation 1970: approccio al trapianto: cure in termini di remissione a lungo termine delle cellule cancerose È mirato e blocca la principale causa della leucemia Anni 20Anni 50Anni 70Anni 80Anni 90 1980 : debutta l’IFN-alfa con poco successo TERAPIA

66 Monitoraggio della risposta Risposta ematologica Risposta citogenetica Risposta molecolare Conta completa delle cellule ematiche Cariotipo (RT-PCR) qualitativa Ibridizzazione in-situ fluorescente (FISH) Reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RQ-PCR)

67 Terapia Convenzionale: Convenzionale: Interferone Interferone Trapianto allogenico di midollo Trapianto allogenico di midollo Trapianto autologo di midollo Trapianto autologo di midollo Terapia molecolare STI-571 (Gleevec) Terapia molecolare STI-571 (Gleevec)

68 Interferone Citochina con effetto antiproliferativo Citochina con effetto antiproliferativo Remissione ematologica in 70-80% Remissione ematologica in 70-80% Risposta citogenetica in 40-60% : Risposta citogenetica in 40-60% : Effetti collaterali Effetti collaterali

69 Terapia Convenzionale: Convenzionale: Interferone Interferone Trapianto allogenico di midollo Trapianto allogenico di midollo Terapia molecolare STI-571 (Gleevec) Terapia molecolare STI-571 (Gleevec)

70 Trapianto di midollo osseo – Unica terapia curativa – Per pazienti in fase cronica – Guarigione totale in > 60% – entro 1-2 anni dalla diagnosi per i migliori risultati – Compatibilità sistema HLA

71 SISTEMA MAGGIORE DI ISTOCOMPATIBILITÀ

72

73 Terapia Convenzionale: Convenzionale: – Idrossiurea Interferone Interferone Trapianto allogenico di midollo Trapianto allogenico di midollo Terapia molecolare STI-571 (Gleevec) Terapia molecolare STI-571 (Gleevec)

74 STI-571 Signal Transduction Inhibitor Signal Transduction Inhibitor STI-571 blocca il legame dell’ATP a BCR-ABL inibendone l’attività kinasica STI-571 blocca il legame dell’ATP a BCR-ABL inibendone l’attività kinasica

75 Imatinib Meccanismo d’azione

76 TERAPIA DELLA LMC GLIVEC: inibitore selettivo della tirosin chinasi BCR/ABL

77 Imatinib Mechanism of Action

78 Glivec (imatinib mesilato) Meccanismo d’azione Traslocazione 9;22 Proteina di fusione Bcr-Abl Glivec Ematopoiesi normale LMC

79 Efficacia del trattamento N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N Ph+ 1 2 3 4 5 N = cellule normali Riduzione della massa leucemica

80 Monitoraggio della risposta: Emocromo 10 x 10 9 /L WBC < 10 x 10 9 /L Platelets <450 x 10 9 /L Citogenetica 0% cell. Ph- Completa 100% cell. Ph- 60%–90% cell. Ph- Parziale 60%–90% cell. Ph- 30%–60% cell. Ph- Minore 30%–60% cell. Ph- PCR QPCR Midollo 3-6-9-12 MESI