Acidi Nucleici : DNA = acido deossiribonucleico depositario dell’informazione genetica RNA: acido ribonucleico trascrizione e traduzione dell’informazione.

Presentazione sul tema: "Acidi Nucleici : DNA = acido deossiribonucleico depositario dell’informazione genetica RNA: acido ribonucleico trascrizione e traduzione dell’informazione."— Transcript della presentazione:

1 Acidi Nucleici : DNA = acido deossiribonucleico depositario dell’informazione genetica RNA: acido ribonucleico trascrizione e traduzione dell’informazione genetica “dogma centrale della biologia molecolare”

2 In alcuni virus l’informazione genetica è codificata nel RNA La trascrittasi inversa converte l’RNA virale in DNA e ne permette l’integrazione nel genoma della cellula ospite

3 Unità costitutive degli acidi nucleici: nucleotidi Base azotata

4 DNA Citosina Timina RNA Citosina Uracile

5 DNA Adenina Guanina RNA Adenina Guanina

6 RNA DNA

7 Base azotata + zucchero = NUCLEOSIDE H2OH2O

8 Base azotata + zucchero + fosfato = NUCLEOTIDE Nucleoside Monofosfato

9 (deossinucleotidi) (nucleotidi)

10 Base azotata + zucchero + fosfato = NUCLEOTIDE Nucleoside Monofosfato Nucleoside Difosfato Nucleoside Trifosfato

11 Tutti i nucleotidi assorbono luce ultravioletta

12 Spettri di assorbimento Nucleotidi (acidi nucleici) Amminoacidi aromatici (proteine)

13 Gli acidi nucleici sono polimeri lineari di nucleotidi Oligonucleotidi… Polinucleotidi…

14 Il DNA ha una struttura a doppio filamento l’RNA ha una struttura a filamento singolo DNA RNA Struttura secondaria

15 Appaiamento complementare delle basi: A-T (2 legami H) C-G (3 legami H) Per ogni molecola di DNA il contenuto di A è uguale al contenuto di T e il contenuto di C è uguale al contenuto di G (regola di Chargaff) Interazioni di van der Waals tra coppie di basi sovrapposte (impilamento – stacking)

16

17

18 Appaiamento complementare delle basi: A-T (2 legami H) C-G (3 legami H)

19 Conseguenza della complementarietà delle basi… l’informazione contenuta nella sequenza di un filamento è conservata nella sequenza dell’altro …ATGCTAACC…. …TACGATTGG….

20 Eliche destrorse bp/giro 10.511 12 Diametro (Å) 2026 18 Inclinazione basi 6°20° 7° solco maggiore solco maggiore poco più profondo profondo solco minore meno profondo stretto e profondo Elica sinistrorsa (favorita da alternanza purine-pirimidine, es: pCGCGCG….) bp = base pair Kb = migliaia di coppie di basi

21 Il DNA a doppia elica può essere denaturato

22 La denaturazione del DNA è un processo reversibile La riassociazione dei filamenti “annealing” è rapida e avviene in una sola tappa se la separazione è incompleta Se i filamenti sono completamente separati la riassociazione avviene in due tappe: 1) appaiamento di un breve segmento complementare (fase più lenta); 2) rinaturazione completa (fase rapida)

23 La denaturazione si accompagna ad un aumento dell’assorbanza a 260 nm: effetto ipercromico

24 a

25 Replicazione del DNA Enzimi coinvolti: DNA polimerasi DNA ligasi elicasi topoisomerasi -Semiconservativa -Bidirezionale -Semidiscontinua Replicazione semiconservativa: Proposta da Watson e Crick - 1953

26 La replicazione del DNA è semiconservativa: Ciascuna molecola figlia È costituita da una catena Parentale e una catena neosintetizzata Esperimento di Meselson-Stahl

27 Replicazione semiconservativa

28 Nei procarioti la replicazione del DNA inizia in un unico sito (origine della replicazione) Negli eucarioti la replicazione inizia in più siti Sia nei procarioti che negli eucarioti la replicazione è bidirezionale

29 La sintesi delle nuove molecole di DNA è catalizzata da DNA polimerasi -Stampo -3’-OH libero (innesco/catena in allungamento) -Nucleosidi 5’-trifosfato (tutti e quattro i nucleotidi devono essere presenti) -Mg 2+

30 replicazione ricombinazione riparazione Enzima principale della replicazione Processività = numero di nucleotidi aggiunti prima che la polimerasi si dissoci Velocità di replicazione in E. coli = circa 1000 nucleotidi/sec Quante DNA polimerasi?....

31 Soluzione al problema 1: -sintesi continua nella direzione di avanzamento della forcella di replicazione (filamento guida/catena veloce) -Sintesi discontinua nella direzione di allontanamento dalla forcella di replicazione (catena lenta: frammenti di Okazaki) La replicazione del DNA è semidiscontinua

32 Problema 2: chi fornisce l’innesco?... Soluzione: DNA primasi: è una RNA polimerasi che sintetizza un breve tratto di RNA (circa 10 nucleotidi) complementare allo stampo di DNA (RNA primer). La DNA primasi utilizza ribonucleosidi 5’- trifosfato e catalizza la formazione del legame fosfodiestere liberando PPi La DNA polimerasi aggiunge poi deossiribonucleotidi all’estremità 3’-OH del RNA primer La DNA polimerasi utilizza deossiribonucleotidi 5’-trifosfato e catalizza la formazione del legame fosfodiestereo liberando PPi

33 Rimozione del primer e sostituzione con un tratto di DNA da parte della DNA polimerasi I

34 1.Attivazione del gruppo fosforico 5’ al punto di interruzione 2. Formazione del legame fosfodiestereo DNA LIGASI Reazione a più passggi Saldatura dei frammenti di Okazaki

35 Negli Eucarioti la replicazione del DNA avviene durante la fase S del ciclo cellulare

36 La trascrizione è molto simile alla replicazione per quanto riguarda:  Meccanismo chimico  Direzione di sintesi  richiesta di uno stampo

37 La trascrizione differisce dalla replicazione perché:  Non richiede un primer  Interessa solo brevi segmenti della molecola di DNA  Nel tratto trascritto, uno solo dei filamenti funge da stampo  L’inizio della trascrizione avviene a livello di sequenze specifiche(regione del promotore) riconosciute dalla RNA polimerasi

38 La trascrizione produce più copie dello stesso gene Funzione del promotore: indica l’inizio del gene che deve essere trascritto

39 L’RNA polimerasi non ha attività esonucleasica e quindi non può effettuare “proofreading” Frequenza di errore: 1 ogni 10 4 -10 5 ribonucleotidi incorporati nell’RNA Elevata processività Le topoisomerasi rimuovono i superavvolgimenti

40 Negli Eucarioti sono presenti TRE tipi di RNA polimerasi RNA polimerasi I (Pol I)sintesi di RNA pre-ribosomiale (un unico trascritto contenente i precursori di rRNA 18S, 5.8S, 28S RNA polimerasi II (Pol II)sintesi degli mRNA RNA polimerasi III (Pol III)sintesi dei tRNA, rRNA 5S piccoli RNA Come avviene la trascrizione negli Eucarioti?....

41 di inizio Fattori di trascrizione (TF) proteine che regolano la trascrizione, ma non sono subunità della RNA polimerasi promotore

42 Modificazioni post-trascrizionali degli mRNA eucariotici (maturazione degli mRNA) Aggiunto prima che la sintesi del trascritto primario sia completata Introni = sequenze non codificanti (eliminati con lo splicing) Esoni = sequenze codificanti

43 cappuccio 5’: - Protegge l’mRNA dalle ribonucleasi - Viene riconosciuta da proteine che legano il ribosoma -guanililtransferasi (nucleo) – da GTP -guanina 7-metiltransferasi (citoplasma) Coda di poliA (40-200 nucleotidi) Aggiunta dalla poliadenilato polimerasi (nucleo) Stabilizza l’mRNA Ne favorisce l’uscita dal nucleo

44 Splicing alternativo snRNP = piccole particelle ribonucleoproteiche nucleari (proteine + snRNA) SPLICING: eliminazione degli introni

45 TRADUZIONE Il linguaggio a 4 lettere (basi) del DNA/RNA viene tradotto nel linguaggio a 20 lettere (amminoacidi) delle proteine

46 Codone = tripletta di nucleotidi codificante per un amminoacido Caratteristiche del codice genetico: Codice a triplette Ridondante (o degenerato) (codoni sinonimi) Specifico (non ambiguo) Universale Non sovrapposto Privo di punteggiatura

47 Il tRNA ha la funzione di “traduttore”(o adattatore) Per ogni amminoacido c’è almeno un tRNA specifico Negli Eucarioti sono presenti circa 50 specie di tRNA

48 Il riconoscimento codone-anticodone avviene secondo le regole dell’appaiamento complementare e antiparallelo Le prime due basi dell’anticodone formano sempre appaiamenti stabili, mentre la terza base forma appaiamenti più deboli (base oscillante, wobble). Conseguenza funzionale: un dato tRNA può riconoscere più di un codone

49 Caratteristiche strutturali del t-RNA -Lunghezza: 73-93 nucleotidi -Residuo pG all’estremità 5’ (nella maggior parte dei t-RNA) -Sequenza CCA all’estremità 3’ -Struttura secondaria a trifoglio -Presenza di basi modificate nelle regioni non appaiate -Struttura tridimensinale a “L” ribaltata  = pseudouridina I = inosina T= ribotimidina D = 5,6-diidrouridina m 1 I= 1-metilinosina m 1 G= 1-metilguanosina m 2 G= N2-dimetilguanosina (Ala) Ansa D Ansa Dell’anticodone Ansa variabile Ansa T  C

50 Step 1: attivazione dell’amminoacido + H 2 O2Pi

51 Step 2: formazione dell’amminoacil-tRNA

52 Il legame tra il t-RNA e l’amminoacido corrispondente è catalizzato dalle amminoacil-tRNA sintetasi Per ogni coppia tRNA-amminoacido esiste una amminoacil-tRNA sintetasi specifica Le amminoacil-tRNA sintetasi hanno attività di “correzione delle bozze”

53 Che cosa determina il corretto posizionamento del mRNA sui ribosomi?... Nei Procarioti: Sequenza di Shine-Dalgarno Negli Eucarioti : la subunità 40S si lega al cappuccio presente all’estremità 5’ dell’mRNA e poi si sposta fino ad incontrare il codone di inizio. PAB = proteina che lega il poli-A eIF = eukaryotic Initiation Factor

54 Tappe della sintesi proteica 1.Inizio 2.Allungamento 3.Terminazione Assemblaggio dei componenti del sistema di traduzione IF = fattori di inizio P= sito peptidilico A = sito amminoacilico

55 Tappe della sintesi proteica 1.Inizio 2.Allungamento 3.Terminazione Assemblaggio dei componenti del sistema di traduzione Nei procarioti il primo amminoacido è formil-Metionina, trasportato dal formil-Met-tRNA Negli eucarioti la sintesi comincia con Met. Solo il fMet-tRNA si lega prima al sito P Tutti gli altri amminoacil-tRNA si posizionano prima nel sito A e solo successivamente nel sito P e nel sito E

56 Tappe della sintesi proteica 1.Inizio 2.Allungamento 3.Terminazione Assemblaggio dei componenti del sistema di traduzione E= sito di uscita (tRNA scarichi) P= sito peptidilico A = sito amminoacilico Sia la subunità minore che la subunità maggiore contribuiscono alla formazione dei siti P e A Il sito E è localizzato completamente sulla subunità maggiore COMPLESSO DI INIZIO

57 Tappe della sintesi proteica 1.Inizio 2.Allungamento 3.Terminazione Posizionamento del secondo amminoacil-tRNA nel sito A Formazione del legame peptidico Traslocazione

58 Tappe della sintesi proteica 1.Inizio 2.Allungamento 3.Terminazione Formazione del legame peptidico catalizzata dall’attività peptidil-transferasica dell’ RNA 23S (ribozima)

59 Tappe della sintesi proteica 1.Inizio 2.Allungamento 3.Terminazione traslocazione

60 Tappe della sintesi proteica 1.Inizio 2.Allungamento 3.Terminazione Si libera la proteina completa I ribosomi, l’mRNA, i tRNA, i vari fattori proteici possono essere riutilizzati nella sintesi di un altro polipeptide RF = Fattori di rilascio

61 Una molecola di mRNA può essere tradotto simultaneamente da numerosi ribosomi (polisomi) La catena polipeptidica comincia a ripiegarsi già durante la sintesi Può andare incontro a modificazioni dopo il completamento della sintesi La proteina finale – ripiegata nella sua conformazione nativa – è biologicamente attiva