ASSICURAZIONE DI QUALITÀ E VALIDAZIONE DEI METODI ANALITICI

ASSICURAZIONE DI QUALITÀ E VALIDAZIONE DEI METODI ANALITICI
Appunti tratti da “ASSICURAZIONE DI QUALITÀ NEL LABORATORIO CHIMICO: VALIDAZIONE DEI METODI DI ANALISI” di E. DESIMONI, B. BRUNETTI Ed. CLUEB 2003

3 Limite di rivelabilità e di quantificazione
Introduzione 1 Introduzione 2 Selettività 3 Limite di rivelabilità e di quantificazione 4 Range dinamico e lineare 5 Esattezza 6 Precisione 7 Incertezza di misurazione 8 Robustezza 9 Recupero 10 Carte di controllo 11 Tavole statistiche 2

Ogni analisi chimica è richiesta per risolvere un problema.
Introduzione Ogni analisi chimica è richiesta per risolvere un problema. Tecnica, metodo, procedura ed eventualmente protocollo di analisi devono essere scelti in base alle necessità del committente (tempo necessario, qualità del risultato, costo). La validazione permette di verificare se quanto scelto e messo a punto dal laboratorio è effettivamente adatto all’utilizzazione prevista ed a soddisfare le esigenze del committente. 3

Scopi della validazione di un metodo di analisi chimica sono:
Introduzione Scopi della validazione di un metodo di analisi chimica sono: provare l’adeguatezza della procedura in esame; documentare la competenza dell’operatore a condurre il lavoro (per mezzo della verifica dei parametri di qualità ottenuti mediante adeguate procedure); fornire dati sufficienti alla definizione dei limiti di controllo utili alla verifica del rispetto dei parametri di qualità durante il lavoro giornaliero. 4

Introduzione L’importanza della validazione dei metodi d’analisi è sancita dalla norma UNI CEI EN ISO/IEC (dalla UNI CEI EN ISO/IEC 17025) … Validazione dei metodi La validazione è la conferma attraverso esame e l’apporto di evidenza oggettiva che i requisiti particolari per l’utilizzazione prevista siano soddisfatti. Il laboratorio deve validare i metodi non normalizzati, i metodi sviluppati/progettati dal laboratorio, i metodi normalizzati utilizzati al di fuori del proprio scopo e campo di applicazione prefissato, come pure estensioni e modifiche di metodi normalizzati per confermare che i metodi siano adatti all'utilizzazione prevista. La validazione deve essere estesa in modo da soddisfare le esigenze di una data applicazione o di un campo di applicazione. Il laboratorio deve registrare i risultati ottenuti, le procedure utilizzate per la validazione, così pure una dichiarazione circa l'idoneità del metodo per l'utilizzo previsto. 5

(dalla UNI CEI EN ISO/IEC 17025)
Introduzione (dalla UNI CEI EN ISO/IEC 17025) Nota 1: La validazione può comprendere procedure per il campionamento, la manipolazione e il trasporto. Nota 2: Le tecniche utilizzate per la determinazione della prestazione di un metodo dovrebbero essere una, o una combinazione delle seguenti: taratura, utilizzando campioni o materiali di riferimento; confronto dei risultati ottenuti con altri metodi; confronti interlaboratorio; valutazione sistematica dei fattori che influenzano il risultato; stima dell’incertezza dei risultati sulla base della conoscenza scientifica dei principi teorici del metodo e dell’esperienza pratica. Nota 3: Quando sono effettuati dei cambiamenti nei metodi non normalizzati validati, l’influenza di tali cambiamenti dovrebbe essere documentata, e se necessario, dovrebbe essere eseguita una nuova validazione. 6

Introduzione (dalla UNI CEI EN ISO/IEC 17025) Il campo e l'accuratezza dei valori ottenibili da metodi validati (per esempio l'incertezza dei risultati, i limiti di rilevazione, la selettività del metodo, la linearità, la ripetibilità e/o la riproducibilità, la robustezza nei confronti di influenze esterne e/o la sensibilità incrociata nei confronti di interferenze provenienti dalla matrice del campione/oggetto da provare), così come valutati per l'utilizzo previsto, devono corrispondere alle esigenze del cliente. Nota 1: La validazione comprende la specifica dei requisiti, la determinazione delle caratteristiche dei metodi, un controllo che i requisiti possano essere soddisfatti utilizzando il metodo e una dichiarazione relativa alla validità. Nota 2: In funzione dello sviluppo del metodo, dovrebbero essere eseguiti riesami regolari per verificare che le esigenze del cliente continuino ad essere soddisfatte. Qualsiasi variazione dei requisiti che richieda modifiche al piano di sviluppo dovrebbe essere approvata e autorizzata. Nota 3: La validazione è sempre un bilancio fra i costi, i rischi e le possibilità tecniche. Vi sono molti casi in cui il campo e l'incertezza dei valori (per esempio l‘accuratezza, i limiti di rilevazione, la selettività, la linearità, la ripetibilità e la riproducibilità, la robustezza e/o la sensibilità alle interferenze) possono essere solo forniti in modo semplificato a causa di mancanza di informazioni. 7

Esempi di situazioni sperimentali richiedenti la validazione:
Introduzione Esempi di situazioni sperimentali richiedenti la validazione: un nuovo metodo analitico è sviluppato per scopi particolari; un metodo analitico in uso deve essere aggiornato, migliorato o esteso ad un nuovo problema analitico; il controllo di qualità evidenzia variazioni nel tempo delle prestazioni del metodo in uso; un metodo analitico in uso deve essere usato in un laboratorio diverso, da un operatore diverso, con una strumentazione diversa; è necessario dimostrare l’equivalenza del metodo analitico in esame con un metodo standard. 8

Introduzione Ogni laboratorio deve assicurarsi che il metodo analitico, scelto in funzione delle esigenze del committente, sia validato. La scelta di metodi analitici validati da organizzazioni internazionali autorizzate, quali l’AOAC International, richiede comunque una verifica della effettiva capacità del laboratorio di applicare il metodo in oggetto: la strumentazione, i materiali ed i reagenti disponibili sono di qualità adeguata? il personale assegnato alle misurazioni è sufficientemente addestrato e competente? i parametri di qualità valutati all’interno del laboratorio sono compatibili con quelli specificati? 9

Introduzione Nel caso si debba validare un metodo analitico ex novo, la via preferibile, anche se spesso non praticabile, è la partecipazione a prove interlaboratori. Il laboratorio che non può partecipare a prove interlaboratori, deve valutare con attenzione: se è in grado di eseguire in proprio la validazione e, in caso affermativo, come; se il metodo analitico così validato potrà essere riconosciuto come tale da altri laboratori; fino a che punto il metodo analitico validato all’interno del laboratorio potrà essere accettato nell’ambito di prove di conformità a limiti legali o norme composizionali. 10

Definizione generale del problema (C)
Introduzione Il laboratorio deve considerare che la validazione di un nuovo metodo analitico riguarda l’intera procedura analitica totale: Definizione generale del problema (C) Definizione analitica del problema (C & A) Scelta di metodo, tecnica, procedura, protocollo (A) Campionamento (C? A?) (Pre)trattamento del campione (A) Analisi (A) Valutazione dei dati (A) Conclusioni (A) Presentazione dei risultati (C & A) C: committente A: chimico analitico 11

Selezione, sviluppo e validazione del metodo analitico
Introduzione Selezione, sviluppo e validazione del metodo analitico 12

Punti focali nell’impostazione della validazione sono:
Introduzione Punti focali nell’impostazione della validazione sono: La valutazione preliminare dei metodi presumibilmente adatti a risolvere il problema specifico in esame. La definizione quantitativa dei parametri di qualità da valutare. La scelta di un metodo. La valutazione del metodo selezionato alla luce dei valori prefissati dei parametri di qualità. La scelta di metodi alternativi qualora quello prescelto si dimostri non adatto. 13

EURACHEM: The Fitness for Purpose of Analytical Methods
Introduzione La validazione implica la valutazione di uno o più parametri di qualità del metodo analitico messo a punto o aggiornato o adottato dal laboratorio. Selettività/specificità Limite di rivelabilità Limite di quantificazione Range dinamico/lineare Accuratezza esattezza precisione Incertezza di misura Robustezza Recupero  EURACHEM: The Fitness for Purpose of Analytical Methods Specificità e recupero Taratura e riferibilità Accuratezza esattezza precisione Incertezza Limite di rivelabilità Campo di applicazione Robustezza  Manuale UNICHIM N. 179/0 Specificità/calibrazione Precisione ripetibilità riproducibilità Esattezza Range di lavoro Limite di rivelabilità Limite di quantificazione Robustezza Sensibilità  NMKL Procedure N. 4 14

Introduzione Lo schema a fianco evidenzia la necessità di pervenire allo stato di controllo statistico prima di procedere alla validazione del metodo. 15

in un laboratorio diverso da un operatore diverso
Introduzione Dato che misurazioni discordanti sono possibili quando l’analisi è ripetuta: la validazione è un processo continuo: ogni modificazione del sistema analitico rende necessaria una nuova fase di validazione. in un laboratorio diverso da un operatore diverso in un diverso intervallo di concentrazione con una strumentazione diversa sullo stesso analita ma in un’altra matrice 16

Le procedure di validazione dipendono dal tipo di analisi da eseguire.
Introduzione Le procedure di validazione dipendono dal tipo di analisi da eseguire. Parametri di interesse nelle procedure di validazione analisi analisi di metodi di: qualitativa quantitativa Accuratezza (esattezza e precisione)  Range dinamico e lineare  Selettività/specificità   Limite di rivelabilità   Limite di quantificazione  Robustezza   Recupero  17

Estensione della validazione:
Introduzione Estensione della validazione: Si deve usare un metodo di analisi: Il LP&T dovrebbe: i parametri di qualità del quale sono stati valutati nell’ambito di una prova di confronto interlaboratorio (interlaboratory method performance study, collaborative trial). verificare se riesce a rispettare almeno i seguenti parametri di qualità: precisione, esattezza e linearità. i parametri di qualità del quale sono stati valutati nell’ambito di una prova di confronto interlaboratorio ma su di una matrice differente. verificare se riesce a rispettare almeno i seguenti parametri di qualità: precisione, esattezza e limite di rivelabilità. ben sperimentato (d’uso generalizzato) i parametri di qualità del quale non sono però stati valutati nell’ambito di una prova di confronto interlaboratorio. verificare se riesce a rispettare almeno i seguenti parametri di qualità: precisione, esattezza, linearità ed eventualmente limite di rivelabilità. descritto in letteratura ma del quale sono stati valutati i principali parametri di qualità. verificare almeno precisione, esattezza, linearità, limite di rivelabilità e robustezza. descritto in letteratura ma del quale non sono noti i parametri di qualità. eseguire una validazione completa. empirico. eseguire una validazione completa. messo a punto all’interno del LP&T. eseguire una validazione completa. precedentemente validato ma in condizioni sperimentali differenti (nuovo analista, nuova strumentazione) o dopo un lungo periodo di inattività o a distanza di tempo dall’ultima volta che il metodo è stato applicato rivalutare tutti i parametri di qualità potenzialmente a rischio di peggioramento, (al minimo range lineare, esattezza, precisione, limite di rivelabilità). 18

In generale, la validazione implica:
Introduzione In generale, la validazione implica: la stesura di una SOP per guidare operativamente la validazione la definizione di scopi e applicazioni del metodo la definizione dei parametri di qualità da valutare la definizione degli esperimenti da eseguire la verifica delle specifiche degli strumenti a disposizione la descrizione della qualità necessaria di standard e reagenti l’esecuzione di esperimenti di pre-validazione la revisione, se necessaria, dei parametri di qualità e dei criteri di accettazione dei risultati l’esecuzione di tutti gli esperimenti necessari (intra-laboratorio ed eventualmente inter-laboratori) la stesura di una SOP (Standard Operating Procedure) per guidare il lavoro di routine la definizione dei criteri di rivalidazione la definizione del tipo e frequenza delle prove di verifica dell’idoneità qualitativa del sistema analitico la stesura del rapporto di validazione

Avvertimenti e precauzioni Definizioni
Introduzione La SOP preliminare è il documento guida della validazione e deve contenere le necessarie informazioni sull’area d’applicabilità del metodo e sugli interferenti più noti, e le istruzioni da seguire lungo tutte le tappe della validazione. Procedura operativa standard per la determinazione del … in campioni di … Scopo (analita, matrice, concentrazione, tecnica, metodo, dimensione del campione, ecc.) Avvertimenti e precauzioni Definizioni Principio della misurazione (meglio se come flow-chart) Reagenti e materiali (inclusi tossicologia, purezza, conservazione, etichettatura, ecc.) Strumentazione (tipo e prestazioni minime tipiche, condizioni ambientali, ecc.) Campionamento e campioni Procedure per la valutazione dei parametri di qualità Formato dei risultati (inclusi arrotondamenti, incertezza, livello di fiducia) ………….

bianco: può essere il bianco dei reagenti o il bianco del campione
Introduzione Gli strumenti tecnici della validazione: bianco: può essere il bianco dei reagenti o il bianco del campione campioni reali: verifica delle interferenze tipiche del lavoro di routine materiali fortificati: utili per il ldr, il recupero, ecc. materiali contenenti l’analita nativo materiali caratterizzati indipendentemente materiali standard usati per calibrazioni materiali di riferimento (meglio se certificati) statistica 21

Schema esemplificativo di SOP di validazione.
Introduzione Schema esemplificativo di SOP di validazione. Revisioni e modificazioni (autorizzate dal responsabile) Titolo Scopo (tipo e specie di analita, matrice, range, tecnica, dimensione del campione Avvertimenti e precauzioni Definizioni (di ogni termine di uso non comune) Principio (meglio se come flow-chart) Reagenti e materiali (inclusi tossicologia, purezza, conservazione, etichettatura, ecc) Strumentazione (tipo e prestazioni minime tipiche, condizioni ambientali, ecc.) Campionamento Conservazione dei campioni Pretrattamenti dei campioni Calibrazione Controllo di qualità (parametri del metodo, tipo e frequenza dei controlli) Criteri di rigetto Procedura (inclusi i punti dove viene eseguito il CQ) Calcoli Espressione dei risultati (inclusi arrotondamenti, incertezza, livello di fiducia) Operatore Riferimenti normativi (utili come background teorico del metodo) Firma del responsabile del servizio 22

Selettività SELETTIVITÀ La selettività è la capacità di un metodo analitico di non risentire della presenza d’interferenti o d’altri componenti diversi dall'analita in esame. Essa può essere valutata analizzando campioni reali e, se possibile, materiali di riferimento (aventi una composizione il più possibile simile a quella dei campioni reali) con il metodo in esame e con un altro metodo indipendente. Procedura: analizzare almeno una volta campioni e materiali di riferimento mediante il metodo in esame e mediante un metodo basato su di un principio fisico indipendente: confrontando i risultati, valutare la capacità del metodo in esame di identificare l’analita e la sua abilità nel determinarlo in presenza di interferenti.

Selettività ESEMPIO N. 1 - Determinazione del selenio nei foraggi mediante riduzione a Se2-, acidificazione a H2Se e determinazione mediante voltammetria di ridissoluzione catodica (CSV). Si sospetta che Pb2+, Zn2+ e Cu2+ possano interferire mediante formazione di seleniuri metallici insolubili. Allo scopo di verificare tale interferenza, il selenio viene analizzato con il metodo in esame e mediante HG-AAS (sistema di campionamento mediante idruri volatili, lampada EDL) in un campione di foraggio contenente i vari interferenti a livello di ng/g. I risultati (ng/g), relativi all’analisi di aliquote indipendenti dello stesso mineralizzato, sono i seguenti: CSV: 0,485; 0,491; 0,480 HG-AAS: 0,498; 0,494; 0,507 Verificare se la concentrazione di selenio ottenuta mediante CSV è significativamente inferiore a quella ottenuta mediante HG-AAS (P = 95%).

1) Verifica dell’omogeneità della varianza:
Selettività 1) Verifica dell’omogeneità della varianza: CSV: C1=0,4853 ng/g; s1 = 5, ng/g; 1 = 2 HG-AAS: C2=0,4997 ng/g; s2 = 6, ng/g; 2 = 2 2) Test-F (a 2 code): Fexp= (s2/s1)2 = 1, F(1-/2=0,95;2,2)= 39,000 Le varianze sono omogenee. 3) Deviazione standard cumulata: 4) Calcolo del valore sperimentale di t : Dato che texp è maggiore di t(1-=0,95,=4) = 2,132, valore critico ad una coda per un numero di gradi di libertà uguale a (n1+n2-2) = 4, la concentrazione di selenio ottenuta mediante CSV è significativamente inferiore a quella ottenuta mediante HG-AAS: ad un livello di fiducia del 95% non si può escludere che il metodo CSV sia affetto da interferenze negative da parte di Pb2+, Zn2+ e Cu2+. 25

Selettività ESEMPIO N. 2 – Il problema è lo stesso dell’Esempio N. 1, ovvero la determinazione del selenio nei foraggi mediante riduzione a Se2-, acidificazione a H2Se e determinazione mediante voltammetria di ridissoluzione catodica (CSV). Allo scopo di verificare la possibile interferenza del piombo, il selenio viene analizzato con il metodo in esame e mediante HG-AAS negli stessi quattro campioni di foraggio contaminati da piombo. I risultati sono i seguenti: CSV: HG-AAS: C1 = 0, C1 = 0,374 C2 = 0, C2 = 0,550 C3 = 0, C3 = 0,219 C4 = 1, C4 = 1,180 Verificare se il risultato ottenuto mediante CSV è significativamente diverso da quello HG-AAS (P = 95%). 26

Il numero di gradi libertà è n-1 = 3.
Selettività 1) Calcolo della media delle differenze e stima della deviazione standard ad esse relativa: d1 = = dm = -0,0307 ng/g d2 = = d3 = = sd = 0,0182 ng/g d4 = ,180 = 2) Test-t a coppie: Il numero di gradi libertà è n-1 = 3. Dato che il valore calcolato di texp è maggiore di quello critico, t(1-/2=0,95,=3) = 3,182, la differenza tra i risultati ottenuti con i due metodi è significativa. Ad un livello di fiducia del 95% non si può escludere che il piombo presente nel campione interferisca nella misurazione. 27

Selettività Alternativamente, la selettività può essere valutata analizzando, con lo stesso metodo di analisi, campioni reali prima e dopo fortificazione con i sospetti interferenti. Procedura: analizzare almeno una volta campioni reali prima e dopo fortificazione con i sospetti interferenti (possibilmente a diversi livelli di concentrazione): valutare se gli interferenti portano a risultati significativamente differenti.

Campione tal quale (mol/L ): 23,4; 22,8; 23,3; 23,1
Selettività ESEMPIO N. 3 - Determinazione dello ione solfuro mediante cromatografia ionica con rivelazione elettrochimica ad un elettrodo di carbone vetroso modificato chimicamente con palladio. Il limite di rivelabilità del metodo in esame è 0,3 mol/L, ma si sospettano interferenze da parte di numerosi analiti, in particolare da parte del glucosio. Allo scopo di verificare l’ipotesi, aliquote indipendenti di un campione sono analizzate prima e dopo fortificazione con 3,5 mmol/L di glucosio. Campione tal quale (mol/L ): 23,4; 22,8; 23,3; 23,1 Campione fortificato (mol/L ): 25,7; 23,3; 24,4; 23,6 Verificare la significatività dell’interferenza (2 code*, P = 95%) mediante confronto dei risultati ottenuti analizzando i campioni tal-quali e dopo fortificazione. * Se le informazioni a disposizioni sono tali da ipotizzare interferenze solo positive (o solo negative) il test può esser eseguito ad una coda.

In questo caso le misurazioni sono indipendenti.
Selettività In questo caso le misurazioni sono indipendenti. 1) Verifica dell’omogeneità della varianza: Tal quale: C1=23,15 mol/L ; s1 = 0,2646 mol/L ; 1 = 3 Fortificato: C2=24,25 mol/L ; s2 = 1,0724 mol/L ; 2 = 3 2) Test-F (a 2 code): Fexp= (s2/s1)2 = 16, F(1-/2=0,95;3,3)= 15,439 Le varianze non sono omogenee. 3) Calcolo di texp : 4) Calcolo dei gradi di libertà:

Selettività Dato che texp = 1,992, è minore di t(1-/2=0,95,=4) = 2,776, valore critico a due code per 4 gradi di libertà, al livello di fiducia prescelto si può escludere che la concentrazione del solfuro misurata in presenza di 3,5 mmol/L di glucosio sia significativamente differente da quella misurata in assenza dell’interferente. L’accettabilità del risultato stimato deve essere valutata in base a criteri prefissati. Il criterio più facilmente adottabile è implicitamente legato al livello di fiducia scelto per eseguire i test statistici. È evidente che la scelta di un livello di fiducia pari al 95% implica l’accettazione del rischio di stime incorrette una volta su venti*. * Si tenga presente che, durante il lavoro di routine, è necessario verificare che tutti i parametri di qualità valutati nel corso della validazione non subiscano variazioni significative. I metodi statistici utili per questo tipo di controlli sono presentati nel capitolo sulle carte di controllo.

LIMITE DI RIVELABILITÀ E DI QUANTIFICAZIONE
Il limite di rivelabilità, o minima quantità rivelabile, ldr, è la concentrazione di analita che produce un segnale significativamente diverso da quello del bianco, ovvero la concentrazione corrispondente al minimo segnale significativo, Ss. Ss è un segnale vicino a quello del bianco (soluzione in cui l'analita è virtualmente assente) ma da esso significativamente differente, e quindi assegnabile all'analita sulla base di un criterio specifico. La definizione del ldr discende dal criterio usato per accertarsi che il segnale sia significativamente diverso da quello del bianco. Il ldr espresso in unità di concentrazione si ricava da Ss tramite la curva di calibrazione.

Limite di rivelabilità
In teoria, per valutare il ldr è quindi necessario eseguire un numero adeguato di misurazioni replicate del bianco, in modo da stimare la distribuzione del segnale ad esso relativo (per ipotesi affetto da rumore Gaussiano). È quindi possibile individuare il minimo segnale significativo, Ss. Avendo scelto come limite decisionale un segnale a nostro giudizio maggiore di quello medio del bianco B-4 B-2 B B+2 B+4 Segnale ammettiamo di poter individuare la presenza dell’analita ogni volta che il segnale del campione in esame risulta maggiore del segnale prescelto.

La valutazione del ldr richiede il confronto di segnali e quindi implica necessariamente la considerazione degli errori falsi positivi e falsi negativi. Infatti, nel decidere se il segnale della soluzione in esame, Sx, è maggiore di quello del bianco, SB è possibile affermare la presenza dell'analita quando esso è assente: si commette allora un errore falso positivo (errore di prima specie o di primo tipo); è possibile affermare che l'analita è assente quando in effetti è presente: si commette allora un errore falso negativo (errore di seconda specie o di secondo tipo).

Un indicatore utile per decidere la presenza/assenza dell’analita è il segnale: B-4 B-2 B B+2 B+4 Segnale S’ = Ss presente assente Se S’, detto (segnale) limite di decisione, fosse scelto come minimo segnale significativo, Ss, e k fosse scelto uguale a 1,645·B, si correrebbe il rischio di decidere la presenza dell’analita quando invece esso è assente solo nel 5% dei casi. La probabilità, , di commettere un errore falso positivo sarebbe uguale al 5%. Spesso questo errore è considerato eccessivo.

Una prima definizione utile di ldr deriva dalla scelta di k = 3. In questo caso la probabilità di commettere un errore falso positivo si riduce allo 0,135 %. Avendo così definito il minimo segnale significativo, si può risalire al limite di rivelabilità dal diagramma di calibrazione. Data la relazione funzionale tra segnale e concentrazione e se la pendenza, b, e l’intercetta, a, sono note con sufficiente accuratezza, il limite di rivelabilità, corrisponde al valore di C quando al posto di S viene sostituito il minimo segnale significativo Ammesso che l’intercetta, a, non sia significativamente diversa dal segnale medio del bianco, B, si ottiene quindi:

 b B-4 B-2 B B+2 B+4 B+6 Segnale presente assente Questa definizione di ldr, forse la più usata, non è adeguata. Infatti, nel caso di un campione contenente una concentrazione di analita tale da corrispondere proprio ad un segnale medio µx = S‘ (Gaussiana verde), l'uso di S' come indicatore decisionale implicherebbe la probabilità  = 50% di commettere un un errore di seconda specie: S’ nel 50% dei casi (area sottesa alla Gaussiana verde, a sinistra del tratto rosso verticale) si potrebbe concludere che il campione non contenga l’analita.

B-4 B-2 B B+2 B+4 B+6 Segnale Ss S’  b B-4 B-2 B B+2 B+4 B+6 Segnale Quindi, è necessario scegliere come concentrazione rappresentante il ldr una concentrazione alla quale corrisponde una distribuzione del segnale ancora più spostata a destra rispetto a quella verde considerata nella figura già vista in precedenza. Nel caso rappresentato nella figura a destra, k > j, quindi  > . Se la deviazione standard del segnale non cambia nell’intervallo di concentrazione considerato

Se k è scelto uguale a j, ed il ldr è definito per  =  = 0,05, si ottiene quindi presente assente Ss B-4 B-2 B B+2 B+4 B+6 Segnale S’ b 

Avendo così ridefinito il minimo segnale significativo, si può risalire al limite di rivelabilità dal diagramma di calibrazione. Data la relazione funzionale tra segnale e concentrazione e sempre se a e b sono noti con sufficiente accuratezza, il limite di rivelabilità, corrisponde sempre al valore di C quando al posto di S viene sostituito il minimo segnale significativo Nell’ipotesi che valgano le approssimazioni già usate in precedenza, otteniamo infine

Nel caso in cui pendenza e intercetta della retta di calibrazione siano affette da incertezza non trascurabile e/o il segnale medio del bianco non sia praticamente uguale all’intercetta, è possibile dimostrare* che il ldr è più correttamente definito dalla seguente equazione dove a e b sono pendenza ed intercetta della retta di calibrazione, e sa e sb le deviazioni standard corrispondenti. Nel caso mB sia praticamente uguale a zero, l’equazione può essere ridotta a * G.L. Long, J.D. Winefordner, Limit of detection. A closer look at the IUPAC definition, Anal. Chem., 55 (1983) 713A

Se anche la deviazione standard sulla pendenza, sb, è molto piccola, l’equazione può essere ulteriormente ridotta a e solo se anche la deviazione standard sull’intercetta, sa, è molto piccola si riottiene l’equazione proposta nella diapositiva 40 È evidente, quindi, che il ldr dovrebbe essere sempre definito usando l’equazione che più si adatta alle condizioni sperimentali reali.

La Figura sottostante illustra la relazione tra (segnale) limite di decisione, S’, e minimo segnale significativo, Ss, e le concentrazioni ad essi corrispondenti, (concentrazione) limite di decisione, ldd, e limite di rivelabilità, ldr. presente assente

Quindi la nuova definizione, nella quale il coefficiente moltiplicativo della deviazione standard del bianco è 3,3 invece di 3, è molto differente dalla precedente, che non tiene conto degli errori falsi negativi. A questo ldr compete  = 0,135% (ma  = 50%). oppure  = 6,68 % e  = 6,68 %. A questo ldr competono  =  = 5% A parità del livello di fiducia prescelto, l’uso di (k+j)·B al posto di k·B implica un peggioramento (innalzamento) del ldr, ma permette di controllare le probabilità  e  di entrambi gli errori. Naturalmente, anche nel secondo modello è possibile scegliere k  1,645. Per esempio, se si volesse limitare sia  che  allo 0,135%, sarebbe necessario usare k = 6.

Limite di quantificazione
Una decisione binaria (analita presente/assente) basata sul confronto del segnale della soluzione in esame con il minimo segnale significativo, non è adeguata nel caso si voglia effettuare un'analisi quantitativa. In questo caso è logico supporre che la deviazione standard debba essere solo una piccola frazione del segnale. Un'analisi può essere definita quantitativa solo se il segnale è 10 o 20 volte maggiore della deviazione standard del bianco. Ne deriva che il limite di quantificazione, ldq (talvolta chiamato limite di determinazione) è definito come segue oppure Mentre il limite di rivelabilità riguarda la capacità di affermare la presenza o l'assenza dell'analita, il limite di quantificazione riguarda la capacità di eseguire una misurazione quantitativa.

Procedura 1 (modello basato su B):
Limite di rivelabilità e di quantificazione Una prima procedura per la valutazione del ldr e del ldq è dettagliata qui di seguito. Procedura 1 (modello basato su B): analizzare 10 campioni indipendenti di bianco o, alternativamente, 10 campioni indipendenti di bianco fortificato con la minima concentrazione accettabile (che produce un segnale misurabile ma diverso da zero, determinata in base a prove preliminari); valutare la deviazione standard dei campioni analizzati; se non è già stata valutata (vedere il Cap. 4: Range dinamico e lineare), stimare la pendenza della curva di calibrazione analizzando almeno sei soluzioni standard (randomizzare); calcolare il ldr e, se richiesto, il ldq.

I valori di assorbanza sono:
Limite di rivelabilità e di quantificazione ESEMPIO N. 4 - Determinazione del limite di rivelabilità per la quantificazione del nitrito nelle acque mediante spettrofotometria VIS (metodo di Griess). Allo scopo viene misurata l’assorbanza a 534 nm di 10 campioni indipendenti del bianco. I valori di assorbanza sono: A1 = 0,005; A2 = 0,004; A3 = 0,006; A4 = 0,011; A5 = 0,008; A6 = 0,007; A7 = 0,013; A8 = 0,012; A9 = 0,005; A10 = 0,007; Pendenza ed intercetta della retta di calibrazione, ottenuta mediante regressione ordinaria lineare ai minimi quadrati dei risultati dell’analisi di 11 soluzioni standard (intervallo di concentrazione: 7, M – 5, M), sono risultate uguali a 4, L/mol e 0,0625. Le corrispondenti deviazioni standard sono risultate uguali a 1634 L/mol e 0,0391, rispettivamente. Valutare ldr e ldq. I dati e la procedura usati per la costruzione della retta di taratura sono quelli usati nella diapositiva N. X, nel capitolo successivo, relativo alla valutazione del Range dinamico e lineare.

1) Calcolo dell’assorbanza media del bianco
Limite di rivelabilità e di quantificazione 1) Calcolo dell’assorbanza media del bianco e della deviazione standard del bianco 2) Calcolo di ldr (eq. 5 del testo a lato;  = 5%;  = 5%): 3) Calcolo di ldr (eq. 6 del testo a lato;  = 5%,  = 5%): I limiti di rivelabilità calcolati negli esercizi sono riportati con tre cifre decimali al fine di consentire il controllo della correttezza dei calcoli. Tuttavia è evidente che essi dovrebbero essere riportati usando al massimo 2 cifre significative. Nei casi trattati nell’esempio si otterrebbe quindi ldr1 = 2, mol/L e, rispettivamente, ldr2 = 2, mol/L.

La differenza tra i due ldr 2,2.10-7 M e 2,7.10-6 M
Limite di rivelabilità e di quantificazione 4) Calcolo di ldq: Nell’esempio sopra presentato, la deviazione standard del bianco, sB, stimata su 10 misurazioni, è stata considerata alla stregua della deviazione standard della popolazione del bianco, B. Così pure è stato fatto per le deviazioni standard di pendenza e intercetta (-2 = 9). La differenza tra i due ldr 2, M e 2, M deriva dal fatto che, in questo caso, pendenza e intercetta della retta di calibrazione erano affette da incertezza non trascurabile e che, inoltre, il segnale medio del bianco non è uguale all’intercetta. Il ldr ed il ldq non dovrebbero essere espressi con più di due cifre significative.

Procedura 2 (modello basato su sy/x o sa):
Limite di rivelabilità e di quantificazione È possibile stimare il limite di rivelabilità usando le informazioni tratte dall’analisi di regressione, quali sy/x (deviazione standard residua della regressione) oppure sa (deviazione standard dell’intercetta) al posto di B. Procedura 2 (modello basato su sy/x o sa): ammesso che non sia già disponibile, ricavare la relazione funzionale segnale/concentrazione; usare la deviazione standard residua, sy/x, (oppure la deviazione standard dell’intercetta, sa) e la pendenza della curva di calibrazione, b, per calcolare il ldr e, se richiesto, il ldq. Citare riferimenti

1) Calcolo di ldr mediante sy/x: ( = 5%,  = 5%)
Limite di rivelabilità e di quantificazione ESEMPIO N. 5 - Calcolare il limite di rivelabilità per la determinazione del nitrito nelle acque mediante spettrofotometria VIS (metodo di Griess) sapendo che la deviazione standard residua, sy/x, ottenuta nel corso della regressione ai minimi quadrati dei risultati dell’analisi di 11 soluzioni standard nell’intervallo di concentrazione 7, M – 5, M, è risultata uguale a 0,0965 e che la deviazione standard dell’intercetta, sa, è risultata uguale a 0,0391. La pendenza, come noto dall’Esempio 4, è risultata essere 4, L/mol. Valutare ldr ( =  = 5%) e ldq (per quest’ultimo, usare 10). 1) Calcolo di ldr mediante sy/x: ( = 5%,  = 5%) 2) Calcolo di ldr mediante sa: I dati e la procedura usati per la costruzione della retta di taratura sono ancora gli stessi di quelli usati nelle diapositive N. X (precedente esempio) e Y (capitolo successivo, relativo alla valutazione del Range dinamico e lineare).

3) Calcolo di ldq mediante sy/x: ( = 5%,  = 5%)
Limite di rivelabilità e di quantificazione 3) Calcolo di ldq mediante sy/x: ( = 5%,  = 5%) 4) Calcolo di ldq mediante sa: Si noti che il limite di rivelabilità ottenuto usando sy/x, ldr = 6,6·10-6 mol/L, è solo poco più alto di quello ottenuto usando il modello basato su sB, ldr = 2,7·10-6 mol/L (DIAPOSITIVA 48), ma solo se si usa l’equazione 6 riportata nel testo a lato, in quanto in questo caso non sono possibili approssimazioni. Infatti usando l’equazione 5 del testo a lato si ottiene un ldr = 2,2·10-7 mol/L, notevolmente inferiore e poco realistico. Si nota invece un accordo sorprendente, almeno in questo caso, tra il valore ottenuto usando l’equazione 6, ldr = 2,7·10-6 mol/L, e quello calcolato usando sa, ldr = 2,7·10-6 M.

In questo modello, il ldq è definito come 3·ldr.
Limite di rivelabilità e di quantificazione Nel modello ULA1 il ldr è la concentrazione interpolata dal segnale corrispondente all’ordinata all’origine del limite di fiducia superiore della retta di regressione. In questo modello, il ldq è definito come 3·ldr. Procedura 3 (ULA1): eseguire la calibrazione (come indicato nel Capitolo 4) valutare il ldr per mezzo dell’equazione Per quanto concerne i risultati negativi, si tenga presente quanto segue [1]: "Naturalmente le concentrazioni non possono essere negative. Tuttavia in questi casi noi non stiamo occupandoci di concentrazioni quanto di misurazioni. Noi possiamo ottenere le concentrazioni solo misurando una proprietà concomitante dell'analita, il segnale, che accettiamo come analogo della concentrazione mediante una calibrazione. Tuttavia l'analogia cade a concentrazione zero o in sua vicinanza, perché il dominio del segnale non è limitato al valore zero, ma ammette valori negativi (per esempio a causa di effetti di matrice o di errori casuali) . Questi valori negativi si traducono in valori negativi della concentrazione e non c'è motivo di censurare tali valori. Stiamo interessandoci di misurazioni, non di teoria.” 1] M. Thompson, Do we really need detection limits?, Analyst, 123 (1998) 405

Confrontare i ldr calcolabili in base ai diversi modelli.
Limite di rivelabilità e di quantificazione ESEMPIO N. 6 - Nel corso di uno studio di validazione (convalida), si desidera valutare il ldr ed il ldq. Allo scopo sono eseguite le misurazioni necessarie alla definizione della funzione di calibrazione (7 x 6 repliche) ed una serie di misurazioni replicate (8) del bianco. I dati (u.a.) sono riportati qui di seguito: Segnali Concentrazione Segnale Deviazione del bianco medio standard 14,6, 0,0 15,3 0,40 15,0 5,0 25,8 0,59 14,9 10,0 41,4 0,43 15,2 15,2 52,8 0,50 15,2 20,0 64,0 0,63 14,7 25,8 81,1 0,82 14,5 31,0 91,9 0,82 14,1 Confrontare i ldr calcolabili in base ai diversi modelli. Anche in questo caso rimangono quindi valide tutte le condizioni precedentemente elencate per quanto riguarda i modelli di ldr basati su sB, ovvero: gli errori casuali seguono una distribuzione normale i parametri della popolazione dei segnali del bianco e del campione ( e µ) sono noti sono assenti errori sistematici il bianco è effettivamente un campione in cui la concentrazione dell'analita è uguale a zero; la varianza del bianco è praticamente uguale a quella dei campioni contenenti concentrazioni di analita molto basse il bianco è la matrice che contiene tutti i campioni e quindi tutti i campioni sono affetti omogeneamente da eventuali interferenze In questo modello il ldr esprime la minima quantità rivelabile come differenza tra valore medio della concentrazione sperimentale fittizia dell’analita nel bianco (risultante da effetti di matrice o da errori casuali) e la concentrazione dell’analita nel campione in esame. Nel caso siano eseguite più repliche del campioni in esame, quest’ultima è la concentrazione media del campione in esame.

La varianza risulta omogenea:
Limite di rivelabilità e di quantificazione La varianza risulta omogenea: Quindi si esegue la regressione lineare ordinaria ai minimi quadrati: r = 0,9991 r2 = 0,9981 b = 2,5110 a = 14,8037 sy/x =1,3270 sb = 0,0485 sa = 0,8957 Inserire commento su bontà del metodo: niente beta. Anche in questi casi i risultati vanno riportati con un numero adeguato di cifre significative: ldr(n = 1) = 0,20 mol/L g.m-3 o, rispettivamente, ldr(n = 1) = 0,12 mol/L g.m-3

Limite di rivelabilità e di quantificazione
I ldr calcolabili in base ai diversi modelli sono elencati qui di seguito:

ldd < Cx < ldr : minore del ldr ldr < Cx < ldq : presente
Limite di rivelabilità e di quantificazione La stima del limite di rivelabilità e del limite di quantificazione permette di definire il formato più corretto per la presentazione dei risultati analitici. Alcuni Autori raccomandano di scrivere il risultato sperimentale (misura) solo quando esso è maggiore del ldq. Se la concentrazione del campione in esame è Cx, e la concentrazione corrispondente al limite di decisione, S’, è ldd, allora il risultato sperimentale dovrebbe essere riportato come segue: Cx < ldd : assente ldd < Cx < ldr : minore del ldr ldr < Cx < ldq : presente ldq < Cx : misura* Secondo altri, il risultato numerico dovrebbe essere riportato in ogni caso. *Si ricorda che, per definizione, una misura è Informazione, (risultato o dato sperimentale), costituita da un numero, un'incertezza ed un'unità di misura, assegnata a rappresentare un parametro in un determinato stato del sistema in esame

Procedura 4 (modello qualitativo):
Limite di rivelabilità e di quantificazione Nel caso sia necessario stimare il limite di rivelabilità di un metodo di analisi qualitativa è necessario usare una diversa procedura. Procedura 4 (modello qualitativo): analizzare 10 volte un numero adeguato di bianchi fortificati a diversi livelli di concentrazione (randomizzare!); costruire la curva (o analizzare i) risultati positivi vs. concentrazione; individuare il livello di concentrazione al quale i risultati positivi sono il 100% (o, se richiesto diversamente, una percentuale minore).

Limite di rivelabilità e di quantificazione
ESEMPIO N. 7 - Verifica del limite di rivelabilità per la determinazione qualitativa dei solfocianuri (saggio con Fe3+ in ambiente acido). Allo scopo sono preparati cinque bianchi fortificati con CNS- a livelli di concentrazione compresi tra 2,5 mg/L e 12,5 mg/L. Dieci aliquote indipendenti di ciascun bianco fortificato sono analizzate al fine di determinare a vista la presenza della colorazione dovuta al prodotto di reazione. Valutare il ldr qualitativo. I risultati positivi relativi ottenuti analizzando ciascun bianco fortificato sono riportati qui di seguito: CCNS- (mg/L) = 2,5 5,0 7,5 10,5 12,5 Npos/Nneg = 1/10 2/10 5/10 10/ /10 I risultati indicano che il ldrqual è CCNS- = 10,5 mg/L (arrotondabile a 10 mg/L ).

RANGE DINAMICO E LINEARE
Il range è l’intervallo di concentrazione esplorato nel corso delle misurazioni. Il range dinamico è l'intervallo di concentrazione nel quale il segnale varia con la concentrazione: i limiti inferiore e superiore del range dinamico corrispondono, rispettivamente, al limite di rivelabilità ed alla più alta concentrazione alla quale un incremento di concentrazione produce ancora un incremento di segnale. Il range lineare esprime l'intervallo di concentrazione nel quale il segnale varia linearmente con la concentrazione. La costruzione del diagramma di calibrazione implica l’adozione di un metodo di regressione. Quello più generalmente adottato è il metodo di regressione lineare ordinaria dei minimi quadrati (OLLSR).

Condizioni necessarie per poter eseguire una OLLSR:
Range dinamico e lineare Condizioni necessarie per poter eseguire una OLLSR: la relazione funzionale segnale/concentrazione deve essere del tipo FI: gli errori sperimentali associati alla variabile indipendente (concentrazione, quantità) devono essere trascurabili rispetto a quelli associati alla variabile dipendente (segnale); gli errori associati alla variabile dipendente devono essere distribuiti normalmente; il sistema analitico deve essere omoschedastico, ovvero la precisione non deve cambiare significativamente al variare della concentrazione; il segnale deve essere funzione lineare della concentrazione. Funzioni di calibrazione da procedure dei minimi quadrati. Anche se è possibile, in teoria, evitare le procedure di calcolo della calibrazione mediante metodi grafici opportuni, le funzioni di calibrazione sono derivate per mezzo di calcoli statistici che permettono di valutare i coefficienti a, b, c, ecc. ed i parametri di qualità ad essi associati ed utili alla verifica della qualità della calibrazione. Protocolli e modi di calibrazione. Mentre la calibrazione è d’uso generale in chimica analitica, il particolare modo operativo dipende dal metodo analitico. In alcuni metodi è sufficiente misurare un solo standard; questa è chiamata calibrazione su punto singolo. Talvolta viene eseguita una calibrazione su due punti, uno su uno standard a bassa concentrazione (quantità) e l’altro su di uno ad alta concentrazione (quantità). I due standard sono scelti in modo da contenere il valore del campione in esame; il più basso può essere il bianco. Questi sono esempi di calibrazione esterna, perché i campioni contenenti la quantità ignota e gli standard a contenuto noto sono fisicamente distinti. Esistono anche modi diversi dalla calibrazione esterna, quali la calibrazione interna, il metodo dell’addizione standard e le tecniche di diluizione isotopica. Nella calibrazione interna, prima della misurazione il campione viene addizionato di una quantità nota di una sostanza diversa dall’analita, ma ad esso chimicamente simile, chiamata standard interno. L’addizione serve a controllare uno stadio critico che potrebbe introdurre un’elevata incertezza nella misurazione. Quindi è opportuno aggiungere questa sostanza sostitutiva prima possibile, nella procedura analitica. È necessario peraltro assicurarsi che lo standard interno sia ben disperso nel campione, e che sia in uno stato fisico (dimensione delle particelle, superficie, ecc.) e di legame compatibile con quello del misurando. L’assunzione alla base del metodo dello standard interno è che misurando e standard interno siano caratterizzati dallo stesso comportamento in tutti gli stadi critici; quindi, il rapporto tra i dati del misurando e dello standard rappresenta un’informazione più affidabile dei dati del solo misurando. Un altro modo è il metodo delle addizioni standard, nel quale il misurando stesso è usato per la calibrazione interna. Allo scopo, prima dell’analisi il campione è suddiviso in subcampioni. Uno di essi è trattato come al solito, mentre gli altri vengono processati dopo aggiunte crescenti di misurando. La determinazione analitica viene eseguita su tutti i subcampioni In generale, lo scopo di questo modo è quello di compensare gli errori proporzionali che derivano dalla differenza dei responsi relativi a standard preparati in soluzioni (per es. etanolo, acqua) aventi composizione diversa dalla matrice dei campioni in esame. In pratica si cerca di correggere la diversa pendenza delle due curve. Al fine di ottenere una buona stima della sensibilità, è necessario aggiungere analita in quantità sufficiente almeno a raddoppiare il segnale. Dato che spesso si eseguono due o tre addizioni standard, con notevole aumento del lavoro per campione, uno svantaggio di questo modo è la minore produttività. Anche la conoscenza delle condizioni di validità di questo metodo è altrettanto importante. La prima è che la curva deve essere rigorosamente lineare anche nel range inferiore dove, a causa della presenza del misurando nel campione, non si possono ottenere dati ma si estrapola a zero. Un’altra assunzione, cruciale nell’analisi di tracce, è che non ci sia un segnale apprezzabile del bianco nel campione, dato che è impossibile verificare sperimentalmente la correttezza di questa condizione. La forma più avanzata di standardizzazione interna è il modo noto come diluizione isotopica. In esso i subcampioni sono addizionati con una sostanza che è la più simile all’analita, chimicamente, pur essendo da esso distinguibile. Lo standard è infatti la stessa sostanza chimica, ma con almeno un atomo nella sua struttura sostituito da un altro isotopo. Spesso, in una sostanza organica si sostituisce un idrogeno con un deuterio, o un 12C con un 13C. Se sono analizzati solo ioni o atomi, allora si aggiunge una quantità nota di ione/atomo in diversa abbondanza isotopica, di modo che il rapporto isotopico del campione venga alterato: più è presente il misurando originale, minore è la variazione totale risultante. Per questa tecnica è necessario disporre di un rivelatore selettivo isotopicamente, pertanto la rivelazione è generalmente eseguita con uno spettrometro di massa. La tecnica è quindi nota come spettrometria di massa a diluizione isotopica per sottolinearne le caratteristiche operative essenziali. Per ottimizzare l’accuratezza, devono essere verificate alcune condizioni: a) L’analita isotopicamente distinguibile deve essere aggiunto in quantità simile a quella presente nel campione. Generalmente, questo implica l’esecuzione di un’analisi preliminare. b) L’aggiunta deve contenere l’analita nello stesso stato chimico del campione. Per esempio, se l’analita è il Cr(H2O)63+, allora il campione deve essere addizionato con Cr(III) esaidrato, e non con CrO42- o con altre forme di cromo. c) Si deve essere sicuri che lo standard sia accuratamente mescolato con il campione prima di ogni pretrattamento chimico del campione. Tuttavia, se possibile, questa tecnica permette di correggere i risultati da recuperi molto incompleti che, inoltre, possono variare da campione a campione. Bisogna stare però attenti a non contaminare il campione dopo l’addizione dello standard. È consigliabile inoltre verificare la presenza di dati anomali (outliers). Ovviamente, l’accettazione dei risultati ottenuti per mezzo del metodo OLLSR implica la verifica delle condizioni che ne consentono l’uso!

Range dinamico e lineare
Provvedimenti: se la relazione funzionale è di tipo FII (entrambe le variabili, dipendente ed indipendente, sono affette da errore sperimentale) si deve ricorrere a metodi specifici di regressione.* se gli errori associati alla variabile dipendente non sono distribuiti normalmente si deve ricorrere a metodi di regressione più robusti (per es. LMS: Least median of squares); se il sistema è eteroschedastico (la precisione varia significativamente con la concentrazione) è necessario ricorrere a trasformazioni dei dati, o a metodi di regressione pesata; se il segnale non è funzione lineare della concentrazione, si deve ridurre l’intervallo di concentrazione esplorato oppure, dopo aver suddiviso l’intervallo in sub-intervalli, si deve eseguire una regressione lineare in ciascuno dei sub-intervalli, oppure ancora si deve ricorrere a metodi di regressione non lineare. * M.G. Natrella, Experimental Statistics, National Bureau of Standards Handbook, US Department of Commerce, National Technical Information Service, Gaithersburg, MD, USA, (1991)

I test statistici a disposizione sono numerosi. Test per normalità:
Range dinamico e lineare I test statistici a disposizione sono numerosi. Test per normalità: test di Shapiro-Wilk Test per omoschedasticità: test-F alla concentrazione minima e massima test di Bartlett test di Cochran Test per linearità: analisi grafica dei residui della regressione test-F su sy/x della regressione quadratica e lineare (test di Mandel) lack-of-fit test Test per outliers: test-F su sy/x prima e dopo eliminazione del dato sospetto I test più affidabili richiedono l’esecuzione di repliche di ciascuna soluzione standard.

ESEMPIO N. 8 – Nel corso della procedura di validazione del metodo spettrofotometrico VIS di analisi del nitrito nelle acque (metodo di Griess), si desidera verificare se il sistema analitico è omoschedastico. Allo scopo sono eseguite 10 repliche di due soluzioni contenenti una concentrazione di nitrito uguale al limite di rivelabilità (2, M, dall’Esempio N. 4, corrispondente al limite inferiore del range lineare) ed al limite superiore del range lineare (6, M, vicina a quella corrispondente alla massima assorbanza consentita dallo strumento). I risultati sono: CNO2- = 2, M Ai: 0,005; 0,006; 0,004; 0,011; 0,008; 0,007; 0,013; 0,012; 0,005; 0,007 CNO2- = 6, M Ai: 2,984; 2,828; 2,769; 2,912; 2,934; 2,902; 2,889; 2,900; 2,997; 2,810 Verificare la normalità dei dati mediante test di Shapiro-Wilk e l’omogeneità della varianza mediante un test-F (P= 95% e P = 99%)

Quindi sono calcolati i valori di
Range dinamico e lineare Per eseguire il test di Shapiro-Wilk i dati relativi alle due concentrazioni (Cb = CNO2- = 2, M e Ca = CNO2- = 6, M) sono disposti in ordine crescente* (vedere esempio a fianco). Quindi sono calcolati i valori di e di bb =8, e ba =0,2137 Quindi è possibile calcolare la statistica del test: Wb = 0,9037 e, rispettivamente, Wa =0,9560 Dato che il valore critico è W( = 0,05;n=10) = 0,842, l’ipotesi di normalità non viene rifiutata in entrambi i casi. Inserire formule Shapiro * Il test è descritto nell’Appendice 3 del testo a lato.

Dopo aver stimato le varianze dei due set di dati
Range dinamico e lineare Avendo accettato l’ipotesi di normalità, si può procedere con il calcolo. Dopo aver stimato le varianze dei due set di dati si calcola il valore di F e lo si confronta con i valori critici (ad una coda): F(1-,9,9) = 3,179 ( = 0,05) e F(1-,9,9) = 5,351 ( = 0,01) Dato che il valore sperimentale è maggiore di entrambi i livelli critici, si può concludere che la varianza non è omogenea nei limiti di entrambi i livelli di fiducia.

Qualora siano disponibili repliche eseguite a più di due concentrazioni differenti, si può usare il test di Cochran. Questo però richiede campioni della stessa numerosità. ESEMPIO N. 9 – In seguito al risultato delle prove citate nell’Esempio N. 8, sono analizzate altre due soluzioni aventi concentrazione 4, M e 1, M. I risultati sono: CNO2- = 4, M Ai: 0,232; 0,211; 0,221; 0,207; 0,247; 0,237 CNO2- = 1, M Ai: 0,902; 0,861; 0,931; 0,891; 0,986; 0,918 Valutare l’omogeneità della varianza (P = 95%) usando questi dati e quelli delle prime sei misurazioni eseguite alle due concentrazioni esplorate nell’Esempio n. 8.

si calcola il valore di g
Range dinamico e lineare Dopo aver stimato le varianze dei quattro set di dati (qui riportati in ordine crescente di concentrazione) si calcola il valore di g e lo si confronta con il valore critico per il livello di significatività prescelto, il numero di osservazioni (6) ed il numero di varianze (4). In questo caso g0,95;6;4= 0,5895. Dato che il valore sperimentale è maggiore di quello critico, al livello di fiducia del 95% non si può escludere che il sistema non sia omoschedastico. I valori critici di g sono riportati nelle Tavole statistiche (Cap. 11).

Distribuzione casuale Deviazione dalla linearità
Range dinamico e lineare Il test più semplice per la verifica della linearità è quello che sfrutta l’analisi grafica dei residui della regressione. Pendenza errata Eterogeneità della varianza Distribuzione casuale Deviazione dalla linearità L’analisi è più significativa se sono eseguite misurazioni replicate dei campioni usati per costruire il diagramma di calibrazione.

verificare possibili outliers (test-F), linearità e omoschedasticità.
Range dinamico e lineare Un’analisi di regressione completa, da condurre mediante misurazioni replicate di ciascun campione standard, consiste di due fasi. Procedura: Fase A analizzare una volta il bianco più almeno 6 materiali di riferimento o bianchi fortificati a diversa concentrazione; riportare il segnale in funzione della concentrazione e identificare approssimativamente il range lineare e gli estremi del range dinamico; Fase B analizzare (tre volte) almeno 6 materiali di riferimento o bianchi fortificati a diversa concentrazione entro il range lineare (randomizzare!); calcolare i coefficienti di regressione più appropriati (coefficiente di correlazione e di determinazione, pendenza, intercetta e relativi intervalli di fiducia); verificare possibili outliers (test-F), linearità e omoschedasticità. I casi possibili e le procedure più idonee sono numerosi. Qui di seguito vengono considerati alcuni tra i più rappresentativi.

Valutare graficamente il range dinamico.
Range dinamico e lineare ESEMPIO N Si desidera sviluppare un metodo rapido per la determinazione dell'etilene sviluppata da specie vegetali palustri mediante mediante spettroscopia fotoacustica (PAS) con eccitazione mediante laser a CO2. Nella fase preliminare sono analizzate 13 miscele gassose contenenti concentrazioni crescenti di etilene. I risultati sono riportati qui di seguito: CC2H2(nL/L) = 0,1 1,0 2,0 5,0 10,0 15,0 Segnale (u.a.) = 53, ,21 82,14 126,80 201,0 274,9 CC2H2(nL/L) = 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 Segnale (u.a.) = 350,0 508,1 642,1 799,9 948,0 1069 CC2H2(nL/L) = 80,0 90,0 100,0 Segnale (u.a.) = Valutare graficamente il range dinamico.

Riportando in grafico i punti sperimentali, si può notare che la sensibilità (segnale/concentrazione) è circa uguale a 15 u.a. (stima grafica), ed è costante fino a livelli di concentrazione dell’ordine di 70 nL/L. Il range dinamico sembra estendersi da 0,1 nL/L a circa di 90 nL/L. Il grafico in basso si traccia riportando il rapporto S/C in funzione di C. Dopo aver valutato visivamente il valore di pendenza (sensibilità) più probabile, si tracciano due rette orizzontali a valori di pendenza uguali al 105% (retta t) e al 95% (retta b) del valore stimato. Il range è lineare fintanto che i punti rappresentanti la sensibilità giacciono all’interno dell’intervallo così definito. Il range lineare si estende, approssimativamente, fino a C = nL/L.

ESEMPIO N. 11 – Determinazione dell’etilene mediante PAS. Avendo determinato il range dinamico e, approssimativamente, quello lineare (vedere Esempio n. 10), si costruisce il diagramma di calibrazione mediante regressione lineare ordinaria ai minimi quadrati (OLLSR). Allo scopo. sono analizzati in triplo sia il bianco tal quale che il bianco fortificato con etilene a otto livelli di concentrazione nel range lineare. I risultati medi delle tre repliche sono i seguenti: CC2H2(nL/L) = 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 Segnale (u.a.) = CC2H2(nL/L) = 50,0 60,0 70,0 80,0 Segnale (u.a.) = Sapendo che il limite di rivelabilità ( =  = 0,05, calcolato in precedenti esperimenti) è 1,5 nL/L, valutare quantitativamente il range lineare e la relazione funzionale Segnale/Concentrazione (P = 95%). Inserire commento su randomizzare. In questo caso il numero di gradi di libertà è N-2 = 9. L’uso dei valori medi non varia i gradi di libertà. I valori medi sono di per sé migliori di quelli singoli e il risultato è automaticamente migliore.

S(C)(u.a.) = (14,16 0,94).C(nL/L)+(61  45) (P = 95%;  = 7)
Range dinamico e lineare La relazione funzionale risultante dall’analisi di tutti i dati è: S(C)(u.a.) = (14,16 0,94).C(nL/L)+(61  45) (P = 95%;  = 7) Il coefficiente di correlazione è r = 0,9973. Esaminando il risultato dell’analisi di regressione si può notare una certa curvatura della curva di calibrazione alle concentrazioni più alte. Anche la distribuzione intorno allo zero dei residui potrebbe indicare una certa curvatura. Il risultato potrebbe migliorare dopo eliminazione del punto relativo a 80 nL/L. Inserire dati parziali validazione. Spiegare linee rosse.

Prima dell’eliminazione (N = 9) Dopo dell’eliminazione (N = 8)
Range dinamico e lineare Sulla base delle precedenti osservazioni si decide di verificare la possibilità di eliminare il punto corrispondente a 80 nL/L. Allo scopo si ripete la procedura OLLSR dopo l’eliminazione del dato. Prima dell’eliminazione (N = 9) Dopo dell’eliminazione (N = 8) r2 = 0, r2 = 0,9974 b = 14,16 0, b = 14,71 0,75 a = 61 a = 48  31 sy/x = 30, sy/x = 19,802 L’eliminazione ha leggermente migliorato il risultato (confrontare i valori di r e di sy/x e gli intervalli di fiducia di pendenza ed intercetta). L’equazione della retta di calibrazione potrebbe essere S(C)(u.a.) = (14,71 0,74).C(nL/L)+(48 31) (P = 95%;  = 6) e non S(C)(u.a.) = (14,16 0,94).C(nL/L)+(61 44) (P = 95%;  = 7) Inserire note su cifre significative dall’incertezza o intervallo di fiducia.

L’esame della curva di calibrazione non mostra più alcuna curvatura apprezzabile. Anche i residui ora sembrano distribuiti casualmente intorno allo zero. Il range lineare si estenderebbe quindi da 1,5 nL/L (dal ldr) a 70 nL/L. Si veda però (nel testo a lato) il risultato del test-F eseguito sui due valori di sy/x.

S(C) = -0,032·C2 + 16,718·C + 30,854 (P = 95%;  = 8; sy/x = 23.876)
Range dinamico e lineare ESEMPIO N. 12 – Verificare la possibilità di analizzare i dati dell’Esempio N. 11 mediante regressione ordinaria non lineare ai minimi quadrati (ONLLSR). I dati sperimentali, gli stessi analizzati con il metodo OLLSR, sono i seguenti: CC2H2(nL/L) = 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 Segnale (u.a.) = CC2H2(nL/L) = 50,0 60,0 70,0 80,0 Segnale (u.a.) = Naturalmente, in questo caso viene conservato anche il punto relativo a C = 80,0 nL/L. Inserire dati parziali L’equazione della curva di calibrazione risulta essere la seguente: S(C) = -0,032·C2 + 16,718·C + 30,854 (P = 95%;  = 8; sy/x = )

I risultati ottenuti mediante OLLSR e ONLLSR possono essere confrontati qui sotto. L’esame visivo dei risultati ottenuti non permette una chiara scelta del metodo migliore. Allo scopo si può usare il test di Mandel (vedere esempio successivo).

Il test di Mandel per la verifica della non-linearità si basa sul confronto delle deviazioni standard residue stimate analizzando gli stessi dati mediante regressione lineare e non lineare (sy/x1 e, rispettivamente, sy/x2). Esso viene eseguito calcolando il valore di TV (test-value) TV deve essere confrontato con il valore critico di F1-,1,N-3 (test ad una coda) relativo al livello di fiducia considerato. Se TV è minore o uguale a F1-,1,N-3, la funzione di calibrazione di secondo ordine non porta a risultati qualitativamente migliori. La non linearità non è significativa.

I due valori della deviazione standard residua sono:
Range dinamico e lineare ESEMPIO N. 13 – Utilizzando il test di Mandel, confrontare i risultati ottenuti analizzando i dati relativi alla determinazione PAS dell’etilene mediante OLLSR e della ONLLSR (P = 95%). I due valori della deviazione standard residua sono: OLLSR sy/x1 = 30,652 ONLLSR sy/x2 = 23,876 TV risulta uguale a: Dato che il valore critico di F è F1-,1,6 = 5,987 si può concludere che la funzione di calibrazione di secondo ordine non porta a risultati significativamente migliori (P = 95%).

Ipicco(nA): 113; 133; 153; 172; 191; 210; 225; 240; 252; 265
Range dinamico e lineare L’uso del coefficiente di correlazione per verificare la linearità non è consigliabile: secondo l’Analytical Committee della RSC, solo r > 0,999 può essere indicativo di linearità. Qui sotto sono riportati i risultati usati nel corso della costruzione di un diagramma di calibrazione nell’ambito dello sviluppo di un metodo per la determinazione del platino in bevande e alimenti liquidi mediante voltammetria catalitica di adsorbimento e ridissoluzione ad un elettrodo a goccia di mercurio pendente. CPt(pg/g): 1,0; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2,0; 2,2; 2,4; 2,6; 2,8 Ipicco(nA): ; 133; 153; 172; 191; 210; 225; 240; 252; 265 Non si può dimostrare la linearità. Si può solo dimostrare l’assenza di non linearità.

Si confronti il risultato con quello ottenuto mediante ONLLSR.
Range dinamico e lineare Si confronti il risultato con quello ottenuto mediante ONLLSR. Tuttavia la struttura dei residui suggerisce l’uso di un modello non lineare. La regressione mediante OLLSR porta ad un risultato caratterizzato da un buon valore del coefficiente di correlazione (r = 0,9963). Nonostante l’alto coefficiente di correlazione valutato con l’OLLSR, la più corretta relazione funzionale è quella non lineare.

La significatività della correlazione può essere
Range dinamico e lineare La significatività della correlazione può essere stimata per mezzo di un apposito test-t: L’ipotesi nulla è che non ci sia correlazione. Quindi, se il valore calcolato è maggiore di quello critico per il livello di fiducia prescelto e N-2 gradi di libertà si evince una correlazione significativa. ESEMPIO N. 14 – Verificare la significatività (P = 95%) della correlazione tra variabile dipendente e variabile indipendente nei due casi sotto indicati: Caso 1: r = 0,8453 n = 5 Caso 2: r = 0,8453 n = 11 Caso 1: Caso 2: Nel caso 1 la correlazione non è significativa, nel caso 2 sì.

Nel caso della OLLSR (Esempio N. 11) si ottiene
Range dinamico e lineare I diagrammi di calibrazione possono essere usati per interpolare la concentrazione di un campione incognito. ESEMPIO N. 15 – L’analisi in triplo dell’etilene sviluppata da un campione reale ha portato al valore medio di segnale S = 318 u.a. Stimare la concentrazione del campione (P = 99%) usando i dati degli Esempi N. 11 e N 12. Nel caso della OLLSR (Esempio N. 11) si ottiene Cx = 18,366 ± 2,386 =18,4 ± 2,4 nL/L (P = 95%;  = 6) Nel caso della ONLLSR (Esempio N. 12) si ottiene Cx = 17,782 ± 2,746 =17,8 ± 2,8 nL/L (P = 95%;  = 6) Vedi Interpol.doc

CAs(aggiunta)(ng/g): 0,0; 4,76; 9,52; 14,28; 19,04
Range dinamico e lineare Quando si usa il metodo delle aggiunte standard, per estrapolare la concentrazione del campione incognito si usano equazioni leggermente diverse da quelle usate nel caso del metodo della curva di calibrazione. ESEMPIO N. 16 – L’arsenico in un campione di zenzero (Zingiber officinale, provenienza Marocco) viene determinato con il metodo delle aggiunte standard mediante DPASV su elettrodo a solido di oro. I risultati dell’analisi di 5 aliquote di mineralizzato (as received + quattro aliquote fortificate con concentrazioni crescenti di analita), sono i seguenti: CAs(aggiunta)(ng/g): 0,0; 4,76; 9,52; 14,28; 19,04 Areapicco(nW): ,065; 19,61; 29,13; 43,05; 52,27 Valutare la concentrazione dell’arsenico nel mineralizzato (P = 95%). Eq-agg-std.doc

Risultati della regressione: r = 0,9982 Sy/x = 1,2306
Range dinamico e lineare Risultati della regressione: r = 0,9982 Sy/x = 1,2306 S(C) = (2,39 ± 0,26).C+(7,4 ± 3,0) ( = 0,05;  = 3) La freccia indica il valore di -Cx. Il risultato può essere scritto come segue: Cas = 3,1 ± 1,6 ng/g (P = 95%;  = 3) Si noti l’incertezza del risultato nonostante il buon valore del coefficiente di correlazione. L’incertezza è determinata dal basso valore della concentrazione dell’analita. Il metodo consiste nel dividere il campione reale in q aliquote uguali, aggiungere una concentrazione crescente di standard a q-1 di esse, eventualmente portare tutte le q soluzioni allo stesso volume con acqua e analizzarle. Se lo standard è abbastanza concentrato è possibile trascurare la diluizione connessa all'aggiunta. Si costruisce quindi la retta di calibrazione riportando sull'asse delle ascisse i valori di concentrazione dello standard aggiunto alle diverse aliquote e assegnando il valore zero all'aliquota in cui (eventualmente) è stata aggiunta la sola acqua. La concentrazione incognita del campione originale può essere ottenuta estrapolando la retta di calibrazione fino ad intersecare l'asse delle ascisse. Se la suddivisione in aliquote e le successive aggiunte di soluzione standard hanno comportato una diluizione significativa del campione originale, il valore estrapolato deve essere incrementato opportunamente.

In teoria, i dati della calibrazione non dovrebbero contenere outliers. Diversi test permettono di riconoscere gli outliers. Uno dei test possibili è il test-F illustrato nell’Esempio seguente. ESEMPIO N. 17 – Nel corso della messa a punto di un metodo per la determinazione dell’indio, in soluzione acida per ac. solforico, mediante FAAS a 303,9 nm, l’analisi di una serie di soluzioni standard ha permesso di ottenere i seguenti dati CIn (g/L): 6,0; 12,0; 16,0; 24,0; 30,0; 38,0 A: ,087; 0,113; 0,170; 0,223; 0,226; 0,341 Il dato S = 0,226 (corrispondente a CIn = 30,0 g/L) è un sospetto outlier. Si desidera verificare l’ipotesi (P = 95%). La letteratura riporta numerosi esempi di fogli di calcolo sviluppati per consentire analisi più interattive e flessibili di quelle consentite dai programmai statistici commerciali. Qui di seguito si riporta un esempio di diagramma di calibrazione ottenuto mediante il programma uwLLSR (unbalanced, weighted Linear Least Square Regression).

Si esegue prima l’analisi dei dati mediante OLLSR. L’analisi viene quindi ripetuta dopo eliminazione del dato sospetto. Qui sotto sono riportati i risultati ottenuti prima e dopo l’eliminazione: Prima Dopo p = 4 d = 3 rp = 0, r d= 0,9953 sy/xp = 0, sy/xd = 0,0113 bp = 0,0075 ± 0,0039 bd = 0,0081 ± 0,0015 ap = 0,036 ± 0,093 ad = 0,031 ± 0,032 Il test-F implica il confronto dei valori di sy/x. Si calcola il valore di Fexp: Dato che Fexp è maggiore del valore critico al livello di fiducia prescelto, F1-,1,3 = 10,128, il dato può essere considerato un outlier e rigettato. Il risultato della calibrazione è quello ottenuto dopo la sua eliminazione.

Qui sotto si possono confrontare i due diagrammi di calibrazione.
Range dinamico e lineare Qui sotto si possono confrontare i due diagrammi di calibrazione.

confrontare il risultato ottenuto con quello vero o assunto come tale.
Esattezza ESATTEZZA L’esattezza è la vicinanza d’accordo tra il valore medio ottenuto da una serie numerosa di risultati e il valore di riferimento accettato. L’esattezza può essere valutata mediante analisi di uno o più materiali di riferimento certificati (CRM). Questi devono avere una composizione il più possibile simile a quella dei campioni reali in esame. Procedura: eseguire 10 analisi replicate del bianco e di un materiale di riferimento con il metodo da validare; se necessario, sottrarre il valore medio del bianco dal valore medio del materiale di riferimento; confrontare il risultato ottenuto con quello vero o assunto come tale.

Calcolo del valore medio e stima della deviazione standard:
Esattezza ESEMPIO N. 18 – Si desidera valutare l’esattezza di un nuovo metodo di analisi elettrochimica del cobalto nelle ceneri di inceneritori comunali. Allo scopo, un operatore analizza ripetutamente il materiale di riferimento certificato CRM176 (cenere di inceneritore cittadino contenente la concentrazione di analita CCo = 30,9 mg/kg). I risultati delle 11 analisi sono i seguenti : CCo (mg/kg) : 28,9; 29,8; 29,9; 30,6; 28,5; 31,2; 32,1; 30,6; 30,9; 31,7; 30,0 Il risultato del bianco non è significativamente diverso da zero. Valutare l’esattezza del risultato fornito dal nuovo metodo (P = 95%). Calcolo del valore medio e stima della deviazione standard: CmCo = 30,382 mg/kg s = 1,103 mg/kg t1-/2,10 = 2,228 Intervallo di fiducia: Risultato: Cexp = 30,38  0,74 mg/kg ( = 0,05;  = 10) L’intervallo di fiducia comprende il valore certificato, 30,9 mg/kg, e quindi non si ha evidenza di bias nei limiti del livello di fiducia prescelto.

Esattezza Alternativamente, l’esattezza può essere valutata mediante confronto dei risultati ottenuti mediante analisi di una serie di campioni (standard o reali) con il metodo da validare e con un metodo di riferimento indipendente. Procedura A: eseguire 10 analisi replicate del bianco e del campione in esame, o di un materiale di riferimento, con il metodo da validare e con un metodo di riferimento indipendente e confrontare i risultati mediante test per il confronto di due medie sperimentali; Procedura B: riportare in grafico i risultati ottenuti analizzando una serie di campioni a diversa concentrazione con il metodo da validare e con quello di riferimento (usare la formulazione per relazioni funzionali di tipo FII): i vari casi possibili sono riportati nella prossima diapositiva.

Esattezza Procedura B

I risultati (%) sono i seguenti:
Esattezza L’esempio sottostante è relativo alla procedura B; si riportano in grafico i risultati ottenuti analizzando una serie di campioni a diversa concentrazione con il metodo da validare (sulle ordinate) e con quello di riferimento (sulle ascisse). ESEMPIO N. 19 – Nel corso dello sviluppo di un nuovo metodo di analisi HPLC della caffeina nel caffè solubile, una serie di campioni contenenti diverse concentrazioni di caffeina viene analizzata (in ordine randomizzato) con il metodo in via di sviluppo e con un metodo standard spettrofotometrico (BS5752: Part 3: 1988 (ISO 4052)). I risultati (%) sono i seguenti: HPLC: 2,0; 3,3; 3,2; 3,0; 4.8; 5,4; 6,0; 5,4; 7,7; 9,0; ISO 4052: 2,1; 3,0; 3,5; 4,1; 4,6; 5,8; 6,2; 6,5; 7,3; 7,5; Valutare l’esattezza (P = 95%). Inserire equazioni FII

* Il test è descritto nell’Appendice 4 del testo a lato.
Esattezza L’ispezione del risultato della regressione FII* indica chiaramente che la retta di regressione ottenuta, è caratterizzata da un’intercetta non significativamente diversa da zero (b0 = -0.6 ± 1.7) e da una pendenza non significativamente diversa da uno, (b1 = 1,11 ± 0.32). L’analisi del diagramma dei residui non evidenzia deviazioni dalla linearità. Il risultato sembra indicare l’assenza di errori sistematici non trascurabili. * Il test è descritto nell’Appendice 4 del testo a lato.

Ripetibilità e riproducibilità sono due tipi di precisione.
La precisione è la bontà dell’accordo tra i risultati di misurazioni successive dello stesso misurando, ovvero la misura della vicinanza reciproca delle misure all'interno di un set di misurazioni su di uno stesso campione. Ripetibilità e riproducibilità sono due tipi di precisione. La ripetibilità è la bontà dell’accordo tra i risultati di misurazioni successive dello stesso misurando condotte nelle stesse condizioni di misurazione. Il limite di ripetibilità, r, è il valore massimo, prevedibile ad un certo livello di fiducia, della differenza assoluta tra due risultati ottenuti in condizioni di ripetibilità: se nelle normali condizioni di lavoro la differenza tra due risultati è maggiore di r, i risultati sono sospetti. La riproducibilità è la bontà dell’accordo tra i risultati di misurazioni successive dello stesso misurando condotte in condizioni di misurazione non omogenee. Il limite di riproducibilità, R, è il valore massimo, prevedibile ad un certo livello di fiducia, della differenza assoluta tra due risultati ottenuti in condizioni di riproducibilità: se nelle normali condizioni di lavoro la differenza tra due risultati è maggiore di R, i risultati sono sospetti.

Procedura per la valutazione della ripetibilità:
Precisione Procedura per la valutazione della ripetibilità: analizzare 10 (N) standard, o materiali di riferimento o bianchi fortificati indipendenti a diversi livelli di concentrazione entro il range dinamico (stesso operatore, strumento, laboratorio; tempo limitato); determinare la deviazione standard e calcolare il limite di ripetibiltà: dove t1-/2, è la t di Student (2 code) per il livello di fiducia desiderato e  = (N-1) gradi di libertà. In pratica, si accetta come possibile l’uso di  =  e quindi, per 1- = 0,95, si usa t1-/2, = 1,96  2); r è la deviazione standard della ripetibilità.

Procedura per la valutazione della riproducibilità:
Precisione Procedura per la valutazione della riproducibilità: analizzare 10 (N) standard, o materiali di riferimento o bianchi fortificati indipendenti a diversi livelli di concentrazione entro il range dinamico (diverso operatore, strumento e laboratorio; tempo esteso); determinare la deviazione standard e calcolare il limite di riproducibilità: dove t1-/2, è la t di Student (2 code) per il livello di fiducia desiderato e  = (N-1) gradi di libertà. In pratica, si accetta come possibile l’uso di  =  e quindi, per 1- = 0,95, si usa t1-/2, = 1,96  2); R è la deviazione standard della riproducibilità. La riproducibilità viene normalmente valutata nel corso di ring test.

Valutare i limiti di ripetibilità alle tre concentrazioni.
Precisione ESEMPIO N. 20 – Nel corso della procedura di validazione del metodo gas-cromatografico di analisi del Dibenzepin nelle urine, si desidera valutare il limite di ripetibilità. Allo scopo sono state analizzate tre soluzioni standard contenenti il farmaco a diverse concentrazioni. Ogni soluzione è stata analizzata 10 volte. Dai risultati è stato possibile stimare le deviazioni standard corrispondenti: C (ng/g) : 350; ; ; sr (ng/g) : 43; 313; 805; Valutare i limiti di ripetibilità alle tre concentrazioni.

È facile verificare che
Precisione È facile verificare che Si supponga ora di eseguire due analisi di un campione contenente circa 3500 ng/g di Dibenzepin in condizioni di ripetibilità. Se la differenza tra i risultati (ng/g) delle due misurazioni è maggiore di 885,3 ng/g, si può concludere che si è verificato un peggioramento della precisione (nei limiti del livello di fiducia prescelto, ovvero il 95%). Far notare quanto è grande r! Alternativamente, dal valore di r l’operatore può decidere se la differenza tra i risultati dell’analisi di due diversi campioni è significativa.

Valutare i limiti di riproducibilità alle tre concentrazioni.
Precisione ESEMPIO N. 21 – Nel corso della procedura di validazione del metodo gas-cromatografico di analisi del Dibenzepin nelle urine, si desidera valutare anche il limite di riproducibilità. Allo scopo sono state analizzate le stesse tre soluzioni standard contenenti il farmaco a diverse concentrazioni ma da diversi analisti, in giorni diversi ed in diversi laboratori. Dai risultati delle dieci repliche eseguite su ciascun campione è stato possibile stimare le deviazioni standard corrispondenti: C (ng/g) : 350; ; ; sr (ng/g) : 63; 390; 885; Valutare i limiti di riproducibilità alle tre concentrazioni.

Il calcolo permette di ottenere i seguenti risultati
Precisione Il calcolo permette di ottenere i seguenti risultati Si supponga ora di eseguire due analisi di un campione contenente circa 350 ng/g di Dibenzepin in condizioni di riproducibilità. Se la differenza tra i due risultati è maggiore di 178 ng/g, si può concludere che si è verificato un peggioramento della precisione (nei limiti del livello di fiducia prescelto, ovvero il 95%). Il peggioramento della precisione delle misure eseguite in condizioni di riproducibilità rispetto a quelle ottenute in condizioni di ripetibilità è risultato alquanto contenuto. Si confrontino i valori di R con quelli di r precedentemente ottenuti (Esempio n. 20): Far notare quanto peggiora R rispetto a r.

INCERTEZZA DI MISURAZIONE
La norma ISO 25, Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement (ISO, Geneva, 1993), definisce l’incertezza di misurazione (UOM)* come un parametro, associato al risultato di una misurazione, che caratterizza la dispersione dei valori che possono essere ragionevolmente attribuiti al misurando qualora siano state considerate tutte le sorgenti d’errore. Il risultato di una misurazione rappresenta la migliore stima del valore del misurando e l’incertezza, valutata considerando tutte le sorgenti d’errore, quantifica la qualità del risultato. Una misura non completata dalla sua incertezza non può essere confrontata né con altre misure né con valori di riferimento o con limiti legali o composizionali. L’importanza dell’incertezza di misurazione come parametro di qualità dei risultati sperimentali è sancita dalla norma UNI CEI EN ISO/IEC Stima dell'incertezza di misura Un laboratorio di taratura, o un laboratorio di prova che esegue le proprie tarature, deve avere e deve applicare una procedura per stimare l'incertezza di misura per tutte le tarature e tipi di taratura. I laboratori di prova devono avere e devono applicare procedure per stimare l'incertezza delle misure. In certi casi la natura dei metodi di prova può escludere il calcolo dell'incertezza di misura rigoroso e valido dal punto di vista metrologico e statistico. In questi casi il laboratorio deve almeno tentare di identificare tutte le componenti dell'incertezza e fare una stima ragionevole, e deve garantire che l'espressione dei risultato non fornisca un'impressione errata dell'incertezza. Una stima ragionevole deve essere basata sulla conoscenza del metodo e sullo scopo della misura e deve far uso, per esempio, delle esperienze precedenti e della validazione dei dati. Nota 1 Il livello di rigore necessario in una stima dell'incertezza di misura dipende da fattori come: - i requisiti dei metodo di prova; - i requisiti dei cliente; - l'esistenza di limiti stretti su cui sono basate le decisioni della conformità ad una specifica. Nota 2 In quei casi in cui un metodo di prova ben conosciuto specifica i limiti delle maggiori sorgenti di incertezza e specifica la forma di presentazione dei risultati calcolati, si ritiene che il laboratorio abbia soddisfatto questo punto, seguendo i metodi di prova e le istruzioni per la presentazione dei risultati (vedere 5.10). Quando si stima l'incertezza di misura, devono essere prese in considerazione, utilizzando appropriati metodi di analisi, tutte le componenti dell'incertezza che sono di rilievo in una data situazione. Le fonti che contribuiscono all'incertezza di misura includono, in modo non esaustivo, i campioni di riferimento e i materiali di riferimento utilizzati, i metodi e le apparecchiature utilizzate, le condizioni ambientali e le condizioni degli oggetti da provare o da tarare, e l'operatore. Il comportamento previsto a lungo termine dell'oggetto sottoposto a prova e/o taratura non è, di regola, preso in considerazione quando si stima l'incertezza di misura. Nota 3 Per ulteriori informazioni vedere ISO 5725 e la Guida all'espressione dell'incertezza di misura (vedere bibliografia). Rapporti di prova In aggiunta a quanto indicato in , i rapporti di prova devono includere, se necessario per l'interpretazione dei risultati, quanto segue: … c) quando applicabile, una dichiarazione circa l'incertezza di misura stimata; informazioni circa l'incertezza sono necessarie nel rapporto di prova quando ciò influisce sulla validità o sull'applicazione dei risultati di prova, quando le istruzioni dei cliente lo richiedono, o quando l'incertezza ha influenza sulla conformità con un limite specificato; L'Assemblea generale dell' European co-operation for Accreditation (EA, Parigi il 6-7 giugno 2000) ha deciso all'unanimità la data di termine del periodo di transizione per l'adeguamento ai requisiti della ISO 17025: 1 gennaio 2003. Entro il primo gennaio 2003 tutti i laboratori accreditati dovranno avere ricevuto una visita di valutazione per accreditamento, riaccreditamento o sorveglianza per la verifica della conformità alla nuova norma. La tempistica prevista per la transizione da EN a UNI CEI EN ISO/IEC è stata aggiornata: per informazioni si vada al sito Internet del SINAL. Dal 1 Ottobre 2001 in poi Accreditamento, sorveglianza, riaccreditamento Valutazione in conformità esclusivamente a ISO/IEC (azioni correttive e approvazione secondo l'usuale tempistica). Emissione nuovo certificato di accreditamento (se non è già stato emesso). Valutazione e accreditamento in conformità a EN non verranno più attuati. * Sebbene Uncertainty of measurement debba essere correttamente tradotto in Incertezza di misurazione, è frequente l’uso di Incertezza di misura.

5.4.6 Stima dell'incertezza di misura
Incertezza di misurazione L’importanza dell’incertezza di misurazione è stata pienamente recepita dalla norma UNI CEI EN ISO/IEC (dalla UNI CEI EN ISO/IEC 17025) 5.4.6 Stima dell'incertezza di misura Un laboratorio di taratura, o un laboratorio di prova che esegue le proprie tarature, deve avere e deve applicare una procedura per stimare l'incertezza di misura per tutte le tarature e tipi di taratura. I laboratori di prova devono avere e devono applicare procedure per stimare l'incertezza delle misure. In certi casi la natura dei metodi di prova può escludere il calcolo dell'incertezza di misura rigoroso e valido dal punto di vista metrologico e statistico. In questi casi il laboratorio deve almeno tentare di identificare tutte le componenti dell'incertezza e fare una stima ragionevole, e deve garantire che l'espressione del risultato non fornisca un'impressione errata dell'incertezza. Una stima ragionevole deve essere basata sulla conoscenza del metodo e sullo scopo della misura e deve far uso, per esempio, delle esperienze precedenti e della validazione dei dati. L’importanza dell’incertezza di misurazione come parametro di qualità dei risultati sperimentali è sancita dalla norma UNI CEI EN ISO/IEC Stima dell'incertezza di misura Un laboratorio di taratura, o un laboratorio di prova che esegue le proprie tarature, deve avere e deve applicare una procedura per stimare l'incertezza di misura per tutte le tarature e tipi di taratura. I laboratori di prova devono avere e devono applicare procedure per stimare l'incertezza delle misure. In certi casi la natura dei metodi di prova può escludere il calcolo dell'incertezza di misura rigoroso e valido dal punto di vista metrologico e statistico. In questi casi il laboratorio deve almeno tentare di identificare tutte le componenti dell'incertezza e fare una stima ragionevole, e deve garantire che l'espressione dei risultato non fornisca un'impressione errata dell'incertezza. Una stima ragionevole deve essere basata sulla conoscenza del metodo e sullo scopo della misura e deve far uso, per esempio, delle esperienze precedenti e della validazione dei dati. Nota 1 Il livello di rigore necessario in una stima dell'incertezza di misura dipende da fattori come: - i requisiti dei metodo di prova; - i requisiti dei cliente; - l'esistenza di limiti stretti su cui sono basate le decisioni della conformità ad una specifica. Nota 2 In quei casi in cui un metodo di prova ben conosciuto specifica i limiti delle maggiori sorgenti di incertezza e specifica la forma di presentazione dei risultati calcolati, si ritiene che il laboratorio abbia soddisfatto questo punto, seguendo i metodi di prova e le istruzioni per la presentazione dei risultati (vedere 5.10). Quando si stima l'incertezza di misura, devono essere prese in considerazione, utilizzando appropriati metodi di analisi, tutte le componenti dell'incertezza che sono di rilievo in una data situazione. Le fonti che contribuiscono all'incertezza di misura includono, in modo non esaustivo, i campioni di riferimento e i materiali di riferimento utilizzati, i metodi e le apparecchiature utilizzate, le condizioni ambientali e le condizioni degli oggetti da provare o da tarare, e l'operatore. Il comportamento previsto a lungo termine dell'oggetto sottoposto a prova e/o taratura non è, di regola, preso in considerazione quando si stima l'incertezza di misura. Nota 3 Per ulteriori informazioni vedere ISO 5725 e la Guida all'espressione dell'incertezza di misura (vedere bibliografia). Rapporti di prova In aggiunta a quanto indicato in , i rapporti di prova devono includere, se necessario per l'interpretazione dei risultati, quanto segue: … c) quando applicabile, una dichiarazione circa l'incertezza di misura stimata; informazioni circa l'incertezza sono necessarie nel rapporto di prova quando ciò influisce sulla validità o sull'applicazione dei risultati di prova, quando le istruzioni dei cliente lo richiedono, o quando l'incertezza ha influenza sulla conformità con un limite specificato; L'Assemblea generale dell' European co-operation for Accreditation (EA, Parigi il 6-7 giugno 2000) ha deciso all'unanimità la data di termine del periodo di transizione per l'adeguamento ai requisiti della ISO 17025: 1 gennaio 2003. Entro il primo gennaio 2003 tutti i laboratori accreditati dovranno avere ricevuto una visita di valutazione per accreditamento, riaccreditamento o sorveglianza per la verifica della conformità alla nuova norma. La tempistica prevista per la transizione da EN a UNI CEI EN ISO/IEC è stata aggiornata: per informazioni si vada al sito Internet del SINAL. Dal 1 Ottobre 2001 in poi Accreditamento, sorveglianza, riaccreditamento Valutazione in conformità esclusivamente a ISO/IEC (azioni correttive e approvazione secondo l'usuale tempistica). Emissione nuovo certificato di accreditamento (se non è già stato emesso). Valutazione e accreditamento in conformità a EN non verranno più attuati.

Incertezza di misurazione (dalla UNI CEI EN ISO/IEC 17025) Nota 1 Il livello di rigore necessario in una stima dell'incertezza di misura dipende da fattori come: - i requisiti dei metodo di prova; - i requisiti dei cliente; - l'esistenza di limiti stretti su cui sono basate le decisioni della conformità ad una specifica. Nota 2 In quei casi in cui un metodo di prova ben conosciuto specifica i limiti delle maggiori sorgenti di incertezza e specifica la forma di presentazione dei risultati calcolati, si ritiene che il laboratorio abbia soddisfatto questo punto, seguendo i metodi di prova e le istruzioni per la presentazione dei risultati (vedere 5.10). L’importanza dell’incertezza di misurazione come parametro di qualità dei risultati sperimentali è sancita dalla norma UNI CEI EN ISO/IEC Stima dell'incertezza di misura Un laboratorio di taratura, o un laboratorio di prova che esegue le proprie tarature, deve avere e deve applicare una procedura per stimare l'incertezza di misura per tutte le tarature e tipi di taratura. I laboratori di prova devono avere e devono applicare procedure per stimare l'incertezza delle misure. In certi casi la natura dei metodi di prova può escludere il calcolo dell'incertezza di misura rigoroso e valido dal punto di vista metrologico e statistico. In questi casi il laboratorio deve almeno tentare di identificare tutte le componenti dell'incertezza e fare una stima ragionevole, e deve garantire che l'espressione dei risultato non fornisca un'impressione errata dell'incertezza. Una stima ragionevole deve essere basata sulla conoscenza del metodo e sullo scopo della misura e deve far uso, per esempio, delle esperienze precedenti e della validazione dei dati. Nota 1 Il livello di rigore necessario in una stima dell'incertezza di misura dipende da fattori come: - i requisiti dei metodo di prova; - i requisiti dei cliente; - l'esistenza di limiti stretti su cui sono basate le decisioni della conformità ad una specifica. Nota 2 In quei casi in cui un metodo di prova ben conosciuto specifica i limiti delle maggiori sorgenti di incertezza e specifica la forma di presentazione dei risultati calcolati, si ritiene che il laboratorio abbia soddisfatto questo punto, seguendo i metodi di prova e le istruzioni per la presentazione dei risultati (vedere 5.10). Quando si stima l'incertezza di misura, devono essere prese in considerazione, utilizzando appropriati metodi di analisi, tutte le componenti dell'incertezza che sono di rilievo in una data situazione. Le fonti che contribuiscono all'incertezza di misura includono, in modo non esaustivo, i campioni di riferimento e i materiali di riferimento utilizzati, i metodi e le apparecchiature utilizzate, le condizioni ambientali e le condizioni degli oggetti da provare o da tarare, e l'operatore. Il comportamento previsto a lungo termine dell'oggetto sottoposto a prova e/o taratura non è, di regola, preso in considerazione quando si stima l'incertezza di misura. Nota 3 Per ulteriori informazioni vedere ISO 5725 e la Guida all'espressione dell'incertezza di misura (vedere bibliografia). Rapporti di prova In aggiunta a quanto indicato in , i rapporti di prova devono includere, se necessario per l'interpretazione dei risultati, quanto segue: … c) quando applicabile, una dichiarazione circa l'incertezza di misura stimata; informazioni circa l'incertezza sono necessarie nel rapporto di prova quando ciò influisce sulla validità o sull'applicazione dei risultati di prova, quando le istruzioni dei cliente lo richiedono, o quando l'incertezza ha influenza sulla conformità con un limite specificato; L'Assemblea generale dell' European co-operation for Accreditation (EA, Parigi il 6-7 giugno 2000) ha deciso all'unanimità la data di termine del periodo di transizione per l'adeguamento ai requisiti della ISO 17025: 1 gennaio 2003. Entro il primo gennaio 2003 tutti i laboratori accreditati dovranno avere ricevuto una visita di valutazione per accreditamento, riaccreditamento o sorveglianza per la verifica della conformità alla nuova norma. La tempistica prevista per la transizione da EN a UNI CEI EN ISO/IEC è stata aggiornata: per informazioni si vada al sito Internet del SINAL. Dal 1 Ottobre 2001 in poi Accreditamento, sorveglianza, riaccreditamento Valutazione in conformità esclusivamente a ISO/IEC (azioni correttive e approvazione secondo l'usuale tempistica). Emissione nuovo certificato di accreditamento (se non è già stato emesso). Valutazione e accreditamento in conformità a EN non verranno più attuati.

Incertezza di misurazione
(dalla UNI CEI EN ISO/IEC 17025) Quando si stima l'incertezza di misura, devono essere prese in considerazione, utilizzando appropriati metodi di analisi, tutte le componenti dell'incertezza che sono di rilievo in una data situazione. Nota 1 Le fonti che contribuiscono all'incertezza di misura includono, in modo non esaustivo, i campioni di riferimento e i materiali di riferimento utilizzati, i metodi e le apparecchiature utilizzate, le condizioni ambientali e le condizioni degli oggetti da provare o da tarare, e l'operatore. Nota 2 Il comportamento previsto a lungo termine dell'oggetto sottoposto a prova e/o taratura non è, di regola, preso in considerazione quando si stima l'incertezza di misura. Nota 3 Per ulteriori informazioni vedere ISO 5725 e la Guida all'espressione dell'incertezza di misura (vedere bibliografia). L’importanza dell’incertezza di misurazione come parametro di qualità dei risultati sperimentali è sancita dalla norma UNI CEI EN ISO/IEC Stima dell'incertezza di misura Un laboratorio di taratura, o un laboratorio di prova che esegue le proprie tarature, deve avere e deve applicare una procedura per stimare l'incertezza di misura per tutte le tarature e tipi di taratura. I laboratori di prova devono avere e devono applicare procedure per stimare l'incertezza delle misure. In certi casi la natura dei metodi di prova può escludere il calcolo dell'incertezza di misura rigoroso e valido dal punto di vista metrologico e statistico. In questi casi il laboratorio deve almeno tentare di identificare tutte le componenti dell'incertezza e fare una stima ragionevole, e deve garantire che l'espressione dei risultato non fornisca un'impressione errata dell'incertezza. Una stima ragionevole deve essere basata sulla conoscenza del metodo e sullo scopo della misura e deve far uso, per esempio, delle esperienze precedenti e della validazione dei dati. Nota 1 Il livello di rigore necessario in una stima dell'incertezza di misura dipende da fattori come: - i requisiti dei metodo di prova; - i requisiti dei cliente; - l'esistenza di limiti stretti su cui sono basate le decisioni della conformità ad una specifica. Nota 2 In quei casi in cui un metodo di prova ben conosciuto specifica i limiti delle maggiori sorgenti di incertezza e specifica la forma di presentazione dei risultati calcolati, si ritiene che il laboratorio abbia soddisfatto questo punto, seguendo i metodi di prova e le istruzioni per la presentazione dei risultati (vedere 5.10). Quando si stima l'incertezza di misura, devono essere prese in considerazione, utilizzando appropriati metodi di analisi, tutte le componenti dell'incertezza che sono di rilievo in una data situazione. Le fonti che contribuiscono all'incertezza di misura includono, in modo non esaustivo, i campioni di riferimento e i materiali di riferimento utilizzati, i metodi e le apparecchiature utilizzate, le condizioni ambientali e le condizioni degli oggetti da provare o da tarare, e l'operatore. Il comportamento previsto a lungo termine dell'oggetto sottoposto a prova e/o taratura non è, di regola, preso in considerazione quando si stima l'incertezza di misura. Nota 3 Per ulteriori informazioni vedere ISO 5725 e la Guida all'espressione dell'incertezza di misura (vedere bibliografia). Rapporti di prova In aggiunta a quanto indicato in , i rapporti di prova devono includere, se necessario per l'interpretazione dei risultati, quanto segue: … c) quando applicabile, una dichiarazione circa l'incertezza di misura stimata; informazioni circa l'incertezza sono necessarie nel rapporto di prova quando ciò influisce sulla validità o sull'applicazione dei risultati di prova, quando le istruzioni dei cliente lo richiedono, o quando l'incertezza ha influenza sulla conformità con un limite specificato; L'Assemblea generale dell' European co-operation for Accreditation (EA, Parigi il 6-7 giugno 2000) ha deciso all'unanimità la data di termine del periodo di transizione per l'adeguamento ai requisiti della ISO 17025: 1 gennaio 2003. Entro il primo gennaio 2003 tutti i laboratori accreditati dovranno avere ricevuto una visita di valutazione per accreditamento, riaccreditamento o sorveglianza per la verifica della conformità alla nuova norma. La tempistica prevista per la transizione da EN a UNI CEI EN ISO/IEC è stata aggiornata: per informazioni si vada al sito Internet del SINAL. Dal 1 Ottobre 2001 in poi Accreditamento, sorveglianza, riaccreditamento Valutazione in conformità esclusivamente a ISO/IEC (azioni correttive e approvazione secondo l'usuale tempistica). Emissione nuovo certificato di accreditamento (se non è già stato emesso). Valutazione e accreditamento in conformità a EN non verranno più attuati.

(dalla UNI CEI EN ISO/IEC 17025) Rapporti di prova In aggiunta a quanto indicato in , i rapporti di prova devono includere, se necessario per l'interpretazione dei risultati, quanto segue: … c) quando applicabile, una dichiarazione circa l'incertezza di misura stimata; informazioni circa l'incertezza sono necessarie nel rapporto di prova quando ciò influisce sulla validità o sull'applicazione dei risultati di prova, quando le istruzioni dei cliente lo richiedono, o quando l'incertezza ha influenza sulla conformità con un limite specificato; L’importanza dell’incertezza di misurazione come parametro di qualità dei risultati sperimentali è sancita dalla norma UNI CEI EN ISO/IEC Stima dell'incertezza di misura Un laboratorio di taratura, o un laboratorio di prova che esegue le proprie tarature, deve avere e deve applicare una procedura per stimare l'incertezza di misura per tutte le tarature e tipi di taratura. I laboratori di prova devono avere e devono applicare procedure per stimare l'incertezza delle misure. In certi casi la natura dei metodi di prova può escludere il calcolo dell'incertezza di misura rigoroso e valido dal punto di vista metrologico e statistico. In questi casi il laboratorio deve almeno tentare di identificare tutte le componenti dell'incertezza e fare una stima ragionevole, e deve garantire che l'espressione dei risultato non fornisca un'impressione errata dell'incertezza. Una stima ragionevole deve essere basata sulla conoscenza del metodo e sullo scopo della misura e deve far uso, per esempio, delle esperienze precedenti e della validazione dei dati. Nota 1 Il livello di rigore necessario in una stima dell'incertezza di misura dipende da fattori come: - i requisiti dei metodo di prova; - i requisiti dei cliente; - l'esistenza di limiti stretti su cui sono basate le decisioni della conformità ad una specifica. Nota 2 In quei casi in cui un metodo di prova ben conosciuto specifica i limiti delle maggiori sorgenti di incertezza e specifica la forma di presentazione dei risultati calcolati, si ritiene che il laboratorio abbia soddisfatto questo punto, seguendo i metodi di prova e le istruzioni per la presentazione dei risultati (vedere 5.10). Quando si stima l'incertezza di misura, devono essere prese in considerazione, utilizzando appropriati metodi di analisi, tutte le componenti dell'incertezza che sono di rilievo in una data situazione. Le fonti che contribuiscono all'incertezza di misura includono, in modo non esaustivo, i campioni di riferimento e i materiali di riferimento utilizzati, i metodi e le apparecchiature utilizzate, le condizioni ambientali e le condizioni degli oggetti da provare o da tarare, e l'operatore. Il comportamento previsto a lungo termine dell'oggetto sottoposto a prova e/o taratura non è, di regola, preso in considerazione quando si stima l'incertezza di misura. Nota 3 Per ulteriori informazioni vedere ISO 5725 e la Guida all'espressione dell'incertezza di misura (vedere bibliografia). Rapporti di prova In aggiunta a quanto indicato in , i rapporti di prova devono includere, se necessario per l'interpretazione dei risultati, quanto segue: … c) quando applicabile, una dichiarazione circa l'incertezza di misura stimata; informazioni circa l'incertezza sono necessarie nel rapporto di prova quando ciò influisce sulla validità o sull'applicazione dei risultati di prova, quando le istruzioni dei cliente lo richiedono, o quando l'incertezza ha influenza sulla conformità con un limite specificato; L'Assemblea generale dell' European co-operation for Accreditation (EA, Parigi il 6-7 giugno 2000) ha deciso all'unanimità la data di termine del periodo di transizione per l'adeguamento ai requisiti della ISO 17025: 1 gennaio 2003. Entro il primo gennaio 2003 tutti i laboratori accreditati dovranno avere ricevuto una visita di valutazione per accreditamento, riaccreditamento o sorveglianza per la verifica della conformità alla nuova norma. La tempistica prevista per la transizione da EN a UNI CEI EN ISO/IEC è stata aggiornata: per informazioni si vada al sito Internet del SINAL. Dal 1 Ottobre 2001 in poi Accreditamento, sorveglianza, riaccreditamento Valutazione in conformità esclusivamente a ISO/IEC (azioni correttive e approvazione secondo l'usuale tempistica). Emissione nuovo certificato di accreditamento (se non è già stato emesso). Valutazione e accreditamento in conformità a EN non verranno più attuati.

Il modello bottom-up è stato poi adottato da EURACHEM [3].
Incertezza di misurazione Dai primi anni ‘80 sono stati proposti numerosi modelli per la stima dell’incertezza di misurazione. Un primo modello, proposto da Wernimont [1], prevedeva la valutazione dell’UOM per mezzo delle stime di precisione eseguite in prove di confronto interlaboratorio (method-performance inter-laboratory studies). Successivamente, ISO ha proposto un modello completamente differente, noto come bottom-up (o error-budget, o component-by-component ), basato sui principi di propagazione degli errori. Le linee guida del modello sono descritte nella Guide to the expression of uncertainty in measurement [2], (nota come GUM). Il modello bottom-up è stato poi adottato da EURACHEM [3]. L’importanza dell’incertezza di misurazione come parametro di qualità dei risultati sperimentali è sancita dalla norma UNI CEI EN ISO/IEC Stima dell'incertezza di misura Un laboratorio di taratura, o un laboratorio di prova che esegue le proprie tarature, deve avere e deve applicare una procedura per stimare l'incertezza di misura per tutte le tarature e tipi di taratura. I laboratori di prova devono avere e devono applicare procedure per stimare l'incertezza delle misure. In certi casi la natura dei metodi di prova può escludere il calcolo dell'incertezza di misura rigoroso e valido dal punto di vista metrologico e statistico. In questi casi il laboratorio deve almeno tentare di identificare tutte le componenti dell'incertezza e fare una stima ragionevole, e deve garantire che l'espressione dei risultato non fornisca un'impressione errata dell'incertezza. Una stima ragionevole deve essere basata sulla conoscenza del metodo e sullo scopo della misura e deve far uso, per esempio, delle esperienze precedenti e della validazione dei dati. Nota 1 Il livello di rigore necessario in una stima dell'incertezza di misura dipende da fattori come: - i requisiti dei metodo di prova; - i requisiti dei cliente; - l'esistenza di limiti stretti su cui sono basate le decisioni della conformità ad una specifica. Nota 2 In quei casi in cui un metodo di prova ben conosciuto specifica i limiti delle maggiori sorgenti di incertezza e specifica la forma di presentazione dei risultati calcolati, si ritiene che il laboratorio abbia soddisfatto questo punto, seguendo i metodi di prova e le istruzioni per la presentazione dei risultati (vedere 5.10). Quando si stima l'incertezza di misura, devono essere prese in considerazione, utilizzando appropriati metodi di analisi, tutte le componenti dell'incertezza che sono di rilievo in una data situazione. Le fonti che contribuiscono all'incertezza di misura includono, in modo non esaustivo, i campioni di riferimento e i materiali di riferimento utilizzati, i metodi e le apparecchiature utilizzate, le condizioni ambientali e le condizioni degli oggetti da provare o da tarare, e l'operatore. Il comportamento previsto a lungo termine dell'oggetto sottoposto a prova e/o taratura non è, di regola, preso in considerazione quando si stima l'incertezza di misura. Nota 3 Per ulteriori informazioni vedere ISO 5725 e la Guida all'espressione dell'incertezza di misura (vedere bibliografia). Rapporti di prova In aggiunta a quanto indicato in , i rapporti di prova devono includere, se necessario per l'interpretazione dei risultati, quanto segue: … c) quando applicabile, una dichiarazione circa l'incertezza di misura stimata; informazioni circa l'incertezza sono necessarie nel rapporto di prova quando ciò influisce sulla validità o sull'applicazione dei risultati di prova, quando le istruzioni dei cliente lo richiedono, o quando l'incertezza ha influenza sulla conformità con un limite specificato; L'Assemblea generale dell' European co-operation for Accreditation (EA, Parigi il 6-7 giugno 2000) ha deciso all'unanimità la data di termine del periodo di transizione per l'adeguamento ai requisiti della ISO 17025: 1 gennaio 2003. Entro il primo gennaio 2003 tutti i laboratori accreditati dovranno avere ricevuto una visita di valutazione per accreditamento, riaccreditamento o sorveglianza per la verifica della conformità alla nuova norma. La tempistica prevista per la transizione da EN a UNI CEI EN ISO/IEC è stata aggiornata: per informazioni si vada al sito Internet del SINAL. Dal 1 Ottobre 2001 in poi Accreditamento, sorveglianza, riaccreditamento Valutazione in conformità esclusivamente a ISO/IEC (azioni correttive e approvazione secondo l'usuale tempistica). Emissione nuovo certificato di accreditamento (se non è già stato emesso). Valutazione e accreditamento in conformità a EN non verranno più attuati. G.T. Wernimont, Use of statistics to develop and evaluate analytical methods, AOAC, Arlington, VA, (1985) ISO, Guide to the expression of uncertainty in measurement, Geneva (1993) EURACHEM, Quantifying uncertainty in analytical measurement, 1st Ed. (1995)

In seguito alle perplessità avanzate da numerosi operatori, l’Analytical Methods Committee (AMC) della Royal Society of Chemistry (RSC) ha proposto un modello [4], noto come top-down, basato su quello di Wernimont. Due anni dopo NMKL (Nordisk Metodik Komité for Levnedsmidler), giudicando il modello bottom-up più adatto a misurazioni fisiche che a misurazioni chimiche, ha sviluppato un modello alternativo più semplice e, allo stesso tempo, utile alla stima dell’incertezza complessiva connessa con l’intera procedura analitica totale [5]. Almeno in linea di principio, la norma UNI CEI EN ISO/IEC ha adottato il modello bottom-up, riferendosi esplicitamente alla GUM nelle sue linee guida. L’importanza dell’incertezza di misurazione come parametro di qualità dei risultati sperimentali è sancita dalla norma UNI CEI EN ISO/IEC Stima dell'incertezza di misura Un laboratorio di taratura, o un laboratorio di prova che esegue le proprie tarature, deve avere e deve applicare una procedura per stimare l'incertezza di misura per tutte le tarature e tipi di taratura. I laboratori di prova devono avere e devono applicare procedure per stimare l'incertezza delle misure. In certi casi la natura dei metodi di prova può escludere il calcolo dell'incertezza di misura rigoroso e valido dal punto di vista metrologico e statistico. In questi casi il laboratorio deve almeno tentare di identificare tutte le componenti dell'incertezza e fare una stima ragionevole, e deve garantire che l'espressione dei risultato non fornisca un'impressione errata dell'incertezza. Una stima ragionevole deve essere basata sulla conoscenza del metodo e sullo scopo della misura e deve far uso, per esempio, delle esperienze precedenti e della validazione dei dati. Nota 1 Il livello di rigore necessario in una stima dell'incertezza di misura dipende da fattori come: - i requisiti dei metodo di prova; - i requisiti dei cliente; - l'esistenza di limiti stretti su cui sono basate le decisioni della conformità ad una specifica. Nota 2 In quei casi in cui un metodo di prova ben conosciuto specifica i limiti delle maggiori sorgenti di incertezza e specifica la forma di presentazione dei risultati calcolati, si ritiene che il laboratorio abbia soddisfatto questo punto, seguendo i metodi di prova e le istruzioni per la presentazione dei risultati (vedere 5.10). Quando si stima l'incertezza di misura, devono essere prese in considerazione, utilizzando appropriati metodi di analisi, tutte le componenti dell'incertezza che sono di rilievo in una data situazione. Le fonti che contribuiscono all'incertezza di misura includono, in modo non esaustivo, i campioni di riferimento e i materiali di riferimento utilizzati, i metodi e le apparecchiature utilizzate, le condizioni ambientali e le condizioni degli oggetti da provare o da tarare, e l'operatore. Il comportamento previsto a lungo termine dell'oggetto sottoposto a prova e/o taratura non è, di regola, preso in considerazione quando si stima l'incertezza di misura. Nota 3 Per ulteriori informazioni vedere ISO 5725 e la Guida all'espressione dell'incertezza di misura (vedere bibliografia). Rapporti di prova In aggiunta a quanto indicato in , i rapporti di prova devono includere, se necessario per l'interpretazione dei risultati, quanto segue: … c) quando applicabile, una dichiarazione circa l'incertezza di misura stimata; informazioni circa l'incertezza sono necessarie nel rapporto di prova quando ciò influisce sulla validità o sull'applicazione dei risultati di prova, quando le istruzioni dei cliente lo richiedono, o quando l'incertezza ha influenza sulla conformità con un limite specificato; L'Assemblea generale dell' European co-operation for Accreditation (EA, Parigi il 6-7 giugno 2000) ha deciso all'unanimità la data di termine del periodo di transizione per l'adeguamento ai requisiti della ISO 17025: 1 gennaio 2003. Entro il primo gennaio 2003 tutti i laboratori accreditati dovranno avere ricevuto una visita di valutazione per accreditamento, riaccreditamento o sorveglianza per la verifica della conformità alla nuova norma. La tempistica prevista per la transizione da EN a UNI CEI EN ISO/IEC è stata aggiornata: per informazioni si vada al sito Internet del SINAL. Dal 1 Ottobre 2001 in poi Accreditamento, sorveglianza, riaccreditamento Valutazione in conformità esclusivamente a ISO/IEC (azioni correttive e approvazione secondo l'usuale tempistica). Emissione nuovo certificato di accreditamento (se non è già stato emesso). Valutazione e accreditamento in conformità a EN non verranno più attuati. Analytical Methods Committee, Uncertainty of Measurement: Implications of Its Use in Analytical Science, Analyst, 129 (1995) 2303 NMKL Procedure N. 5, Estimation and expression of measurement uncertainty in chemical analysis, NMKL (1997)

Successivamente, la seconda edizione della Guida EURACHEM [6] e la IUPAC [7] hanno proposto, per la stima dell’incertezza di misurazione, di usare anche i dati acquisiti nel corso di studi di validazione (modello bottom-up integrato). Infine, Barwick ed Ellison [8] hanno predisposto un protocollo per utilizzare i risultati degli studi di validazione nella stima dell’incertezza di misura. In pratica l’approccio, sempre del tipo bottom-up integrato, descrive come i dati ottenuti nei test di robustezza permettano di valutare opportunamente tutte le sorgenti d’incertezza non considerate dagli studi di esattezza e precisione. L’importanza dell’incertezza di misurazione come parametro di qualità dei risultati sperimentali è sancita dalla norma UNI CEI EN ISO/IEC Stima dell'incertezza di misura Un laboratorio di taratura, o un laboratorio di prova che esegue le proprie tarature, deve avere e deve applicare una procedura per stimare l'incertezza di misura per tutte le tarature e tipi di taratura. I laboratori di prova devono avere e devono applicare procedure per stimare l'incertezza delle misure. In certi casi la natura dei metodi di prova può escludere il calcolo dell'incertezza di misura rigoroso e valido dal punto di vista metrologico e statistico. In questi casi il laboratorio deve almeno tentare di identificare tutte le componenti dell'incertezza e fare una stima ragionevole, e deve garantire che l'espressione dei risultato non fornisca un'impressione errata dell'incertezza. Una stima ragionevole deve essere basata sulla conoscenza del metodo e sullo scopo della misura e deve far uso, per esempio, delle esperienze precedenti e della validazione dei dati. Nota 1 Il livello di rigore necessario in una stima dell'incertezza di misura dipende da fattori come: - i requisiti dei metodo di prova; - i requisiti dei cliente; - l'esistenza di limiti stretti su cui sono basate le decisioni della conformità ad una specifica. Nota 2 In quei casi in cui un metodo di prova ben conosciuto specifica i limiti delle maggiori sorgenti di incertezza e specifica la forma di presentazione dei risultati calcolati, si ritiene che il laboratorio abbia soddisfatto questo punto, seguendo i metodi di prova e le istruzioni per la presentazione dei risultati (vedere 5.10). Quando si stima l'incertezza di misura, devono essere prese in considerazione, utilizzando appropriati metodi di analisi, tutte le componenti dell'incertezza che sono di rilievo in una data situazione. Le fonti che contribuiscono all'incertezza di misura includono, in modo non esaustivo, i campioni di riferimento e i materiali di riferimento utilizzati, i metodi e le apparecchiature utilizzate, le condizioni ambientali e le condizioni degli oggetti da provare o da tarare, e l'operatore. Il comportamento previsto a lungo termine dell'oggetto sottoposto a prova e/o taratura non è, di regola, preso in considerazione quando si stima l'incertezza di misura. Nota 3 Per ulteriori informazioni vedere ISO 5725 e la Guida all'espressione dell'incertezza di misura (vedere bibliografia). Rapporti di prova In aggiunta a quanto indicato in , i rapporti di prova devono includere, se necessario per l'interpretazione dei risultati, quanto segue: … c) quando applicabile, una dichiarazione circa l'incertezza di misura stimata; informazioni circa l'incertezza sono necessarie nel rapporto di prova quando ciò influisce sulla validità o sull'applicazione dei risultati di prova, quando le istruzioni dei cliente lo richiedono, o quando l'incertezza ha influenza sulla conformità con un limite specificato; L'Assemblea generale dell' European co-operation for Accreditation (EA, Parigi il 6-7 giugno 2000) ha deciso all'unanimità la data di termine del periodo di transizione per l'adeguamento ai requisiti della ISO 17025: 1 gennaio 2003. Entro il primo gennaio 2003 tutti i laboratori accreditati dovranno avere ricevuto una visita di valutazione per accreditamento, riaccreditamento o sorveglianza per la verifica della conformità alla nuova norma. La tempistica prevista per la transizione da EN a UNI CEI EN ISO/IEC è stata aggiornata: per informazioni si vada al sito Internet del SINAL. Dal 1 Ottobre 2001 in poi Accreditamento, sorveglianza, riaccreditamento Valutazione in conformità esclusivamente a ISO/IEC (azioni correttive e approvazione secondo l'usuale tempistica). Emissione nuovo certificato di accreditamento (se non è già stato emesso). Valutazione e accreditamento in conformità a EN non verranno più attuati. EURACHEM, Quantifying uncertainty in analytical measurement, 2nd Ed. (2000) Report on the FAO, IAEA, AOAC Int., IUPAC International Workshop on Principles and Practices of Method Validation, Budapest (1999) V.J. Barwick, S.R.L. Ellison, VAM Project Development and Harmonisation of Measurement Uncertainty Principles. Part d. Protocol for uncertainty evaluation from validation data. Version 5.1 (2000)

L’attuale coesistenza di diversi modelli per la valutazione dell’incertezza di misurazione, e l’aumento dei costi e tempi di analisi derivante dalla loro applicazione, hanno trasformato la stima dell’incertezza di misurazione in uno dei maggiori problemi affrontati dai laboratori che vogliono introdurre un sistema di controllo qualità, o che hanno come obiettivo l’accreditamento dei loro metodi di analisi. L’importanza dell’incertezza di misurazione come parametro di qualità dei risultati sperimentali è sancita dalla norma UNI CEI EN ISO/IEC Stima dell'incertezza di misura Un laboratorio di taratura, o un laboratorio di prova che esegue le proprie tarature, deve avere e deve applicare una procedura per stimare l'incertezza di misura per tutte le tarature e tipi di taratura. I laboratori di prova devono avere e devono applicare procedure per stimare l'incertezza delle misure. In certi casi la natura dei metodi di prova può escludere il calcolo dell'incertezza di misura rigoroso e valido dal punto di vista metrologico e statistico. In questi casi il laboratorio deve almeno tentare di identificare tutte le componenti dell'incertezza e fare una stima ragionevole, e deve garantire che l'espressione dei risultato non fornisca un'impressione errata dell'incertezza. Una stima ragionevole deve essere basata sulla conoscenza del metodo e sullo scopo della misura e deve far uso, per esempio, delle esperienze precedenti e della validazione dei dati. Nota 1 Il livello di rigore necessario in una stima dell'incertezza di misura dipende da fattori come: - i requisiti dei metodo di prova; - i requisiti dei cliente; - l'esistenza di limiti stretti su cui sono basate le decisioni della conformità ad una specifica. Nota 2 In quei casi in cui un metodo di prova ben conosciuto specifica i limiti delle maggiori sorgenti di incertezza e specifica la forma di presentazione dei risultati calcolati, si ritiene che il laboratorio abbia soddisfatto questo punto, seguendo i metodi di prova e le istruzioni per la presentazione dei risultati (vedere 5.10). Quando si stima l'incertezza di misura, devono essere prese in considerazione, utilizzando appropriati metodi di analisi, tutte le componenti dell'incertezza che sono di rilievo in una data situazione. Le fonti che contribuiscono all'incertezza di misura includono, in modo non esaustivo, i campioni di riferimento e i materiali di riferimento utilizzati, i metodi e le apparecchiature utilizzate, le condizioni ambientali e le condizioni degli oggetti da provare o da tarare, e l'operatore. Il comportamento previsto a lungo termine dell'oggetto sottoposto a prova e/o taratura non è, di regola, preso in considerazione quando si stima l'incertezza di misura. Nota 3 Per ulteriori informazioni vedere ISO 5725 e la Guida all'espressione dell'incertezza di misura (vedere bibliografia). Rapporti di prova In aggiunta a quanto indicato in , i rapporti di prova devono includere, se necessario per l'interpretazione dei risultati, quanto segue: … c) quando applicabile, una dichiarazione circa l'incertezza di misura stimata; informazioni circa l'incertezza sono necessarie nel rapporto di prova quando ciò influisce sulla validità o sull'applicazione dei risultati di prova, quando le istruzioni dei cliente lo richiedono, o quando l'incertezza ha influenza sulla conformità con un limite specificato; L'Assemblea generale dell' European co-operation for Accreditation (EA, Parigi il 6-7 giugno 2000) ha deciso all'unanimità la data di termine del periodo di transizione per l'adeguamento ai requisiti della ISO 17025: 1 gennaio 2003. Entro il primo gennaio 2003 tutti i laboratori accreditati dovranno avere ricevuto una visita di valutazione per accreditamento, riaccreditamento o sorveglianza per la verifica della conformità alla nuova norma. La tempistica prevista per la transizione da EN a UNI CEI EN ISO/IEC è stata aggiornata: per informazioni si vada al sito Internet del SINAL. Dal 1 Ottobre 2001 in poi Accreditamento, sorveglianza, riaccreditamento Valutazione in conformità esclusivamente a ISO/IEC (azioni correttive e approvazione secondo l'usuale tempistica). Emissione nuovo certificato di accreditamento (se non è già stato emesso). Valutazione e accreditamento in conformità a EN non verranno più attuati.

MODELLO BOTTOM-UP (EURACHEM)
Incertezza di misurazione: modello bottom-up MODELLO BOTTOM-UP (EURACHEM) Il modello bottom-up, schematizzato in Figura, richiede: la definizione del misurando l’identificazione delle sorgenti d’incertezza la quantificazione delle incertezze d’ingresso il calcolo dell’incertezza composta

Incertezza di misurazione: modello bottom-up
L’obiettivo di una misurazione è la determinazione del valore della grandezza da misurare, Y, detta misurando. Il misurando è espresso in funzione di grandezze d’ingresso, X1, X2, ecc.: L’equazione rappresenta il modello di misurazione. In realtà, il processo di misurazione permette di ottenere solo una stima, y, del misurando mediante sostituzione nell’eq. 1 delle stime (delle grandezze) di ingresso, xi:

Definizione incompleta del misurando Campionamento (?)
Incertezza di misurazione: modello bottom-up Definizione incompleta del misurando Campionamento (?) Estrazione/preconcentrazione incompleta Effetti di matrice ed interferenze Contaminazioni Conoscenza o controllo inadeguato delle condizioni ambientali che influenzano il risultato Bias personali nella lettura degli strumenti Incertezza di masse e volumi Incertezze legate alla risoluzione e sensibilità strumentali Incertezza del valore assegnato a CRM Incertezza del valore di costanti e parametri usati nell’algoritmo di riduzione dei dati Approssimazioni e assunzioni implicite del metodo analitico Errori casuali Algoritmi inadeguati di software commerciali

Ad ognuna delle stime d’ingresso deve essere associata una incertezza tipo d’ingresso. Le incertezze tipo d’ingresso sono definite di categoria A, se possono essere stimate come deviazioni standard di parametri valutati mediante analisi statistica di risultati sperimentali (deviazione standard di una media, della pendenza di un diagramma di calibrazione, ecc.). Le incertezze tipo d’ingresso sono definite di categoria B se derivano da informazioni relative alla strumentazione o ai materiali di riferimento (tolleranze della vetreria, incertezza del valore certificato di un materiale di riferimento, precisione di un termometro, ecc.).

Stima delle incertezze standard dalle incertezze d’ingresso di categoria B: Nessuna informazione sulla distribuzione: a1a2 oppure a1=a2 a1 a2 .(a2-a1) xm I valori agli estremi sono meno probabili di quelli centrali: Per una distribuzione triangolare: Le incertezze di categoria B hanno infiniti gradi di libertà.

Fondamentale, ai fini della correttezza della stima dell’incertezza tipo composta, è il bilancio delle incertezze, definito mediante l’analisi causa-effetto e visualizzato per mezzo dei diagrammi a spina di pesce (diagrammi di Ishikawa). Scopo principale del diagramma, in metrologia chimica, è l’identificazione di tutte le sorgenti d’incertezza. Problema da risolvere (effetto) Causa principale Livello 1 (causa) Livello 2 (causa) Livello 3 (causa) Livello 2 (causa)

Il diagramma di Ishikawa può risultare molto complesso.
Incertezza di misurazione: modello bottom-up Il diagramma di Ishikawa può risultare molto complesso. EURACHEM/CITAC Guide (2000) Quantifying uncertainty in analytical measurement, 2a Edizione, S.L.R. Ellison, M. Rosslein, A. Williams Editori, EURACHEM Secretariat, Teddington, UK

P. de Zorzi , M. Belli , S. Barbizzi , S. Menegon , A. Deluisa, A practical approach to assessment of sampling uncertainty, Accred. Qual, Assur., 7 (2002) 182

Avendo individuato tutte le incertezze d’ingresso, si può calcolare l’incertezza tipo composta, u(y). Per il principio di propagazione degli errori casuali, u(y) può essere calcolata combinando tutte le sorgenti d’incertezza espresse come incertezze standard: dove xi (i = 1…n) sono la grandezze d’ingresso (che determinano il risultato analitico), u(xi) è l’incertezza del parametro iesimo espressa come deviazione standard e cov(xij) è la covarianza tra xi e xji.

Quando tutte le grandezze d’ingresso sono indipendenti e tra loro non correlate, cov(xij) è uguale a zero e l’incertezza tipo composta di un misurando può essere calcolata da: Esempi:

CAMPIONAMENTO La considerazione del contributo del campionamento nella stima dell’incertezza composta è alquanto controversa. Secondo alcuni ricercatori, l’incertezza del campionamento dovrebbe essere considerata solo se il campionamento è parte della metodo in esame. Secondo altri*, senza il contributo dell’incertezza del campionamento (spesso la componente più importante) la stima dell’incertezza di misurazione è priva di significato. * J.L. Love, Chemical metrology, chemistry and the uncertainty of chemical measurements, Accred. Qual. Assur., 7 (2002) 95

INCERTEZZA DEL CAMPIONAMENTO
Incertezza di misurazione: modello bottom-up INCERTEZZA DEL CAMPIONAMENTO La stima dell’incertezza legata al campionamento, us, può essere eseguita mediante un opportuno disegno sperimentale. Un esempio di disegno adatto allo scopo* è presentato in Figura. Target indica la massa di materiale che deve essere rappresentata dal campione (sample) di laboratorio. In questo disegno, m targets simili in composizione sono campionati in duplicato ed ogni campione è analizzato in duplicato. * M. Thompson, Uncertainty of sampling in chemical analysis, Accred. Qual. Assur., 3 (1998) 117 123 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

La varianza del campionamento, s2, è calcolata come segue*:
Incertezza di misurazione: modello bottom-up La varianza del campionamento, s2, è calcolata come segue*: dove MSB e MSW sono la media dei quadrati delle differenze (mean square) inter-campioni (MSB) e, rispettivamente, intra-campioni (MSW) mentre n è scelto uguale a 2 perché le misurazioni sono state eseguite in doppio. 124 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Il calcolo può essere eseguito mediante ANOVA. Analizzando i seguenti dati Analisi Analisi si ottiene facilmente jj = 8 Ii = 2 125 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Nell’ipotesi che si voglia comprendere l’incertezza del campionamento, u(Cs) (= s) l’incertezza composta diventa: dove u(Cs) è la concentrazione media dell’analita nei campioni analizzati per valutare l’incertezza del campionamento. Si tenga presente che l’incertezza del campionamento può essere la componente dominante nel bilancio delle incertezze.

Moltiplicando l’incertezza tipo composta, u(y) (o u(y)corr)), per un opportuno fattore di copertura, k, si ottiene l’incertezza estesa, U(y): Il fattore di copertura permette di associare un livello di fiducia all’incertezza estesa, e corrisponde alla variabile normale standardizzata, z: valori di k uguali a 1,96 (più spesso arrotondato a 2) e, rispettivamente, 2,58 (più spesso arrotondato a 2,6), indicano la selezione del livello di fiducia del 95% e, rispettivamente, del 99%. Nel campo delle misurazioni chimiche, a meno di particolari esigenze, si suggerisce l’uso di k = 2. È importante osservare che questa scelta presuppone la conoscenza di valori molto affidabili delle incertezze tipo d’ingresso, tali da permettere l’assegnazione di un numero di gradi di libertà molto alto ( ) all’incertezza composta, u(y). 127 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

In caso contrario, è necessario usare il fattore di copertura corretto, t(1-/2),, valido per il numero effettivo di gradi di libertà di u(y). Il numero effettivo di gradi di libertà può essere ottenuto combinando i gradi di libertà, i, delle singole componenti u(xi) mediante l’approssimazione di Welch-Satterthwaite: Dato che i gradi di libertà delle incertezze tipo d’ingresso di categoria B sono infiniti, i corrispondenti contributi nel denominatore dell’approssimazione di Welch-Satterthwaite sono nulli. 128 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

L’esempio di calcolo dell’incertezza riportato nelle prossime diapositive, sebbene inerente ad un caso relativamente semplice, permette di descrivere dettagliatamente la procedura bottom-up (EURACHEM) di valutazione dell’incertezza di misurazione. In particolare, esso permette di introdurre l’analisi causa-effetto per mezzo dei diagrammi di Ishikawa. ESEMPIO N. 22 – Nel corso della procedura di validazione del metodo spettrofotometrico VIS di analisi del nitrito nelle acque, ed in mancanza di materiali di riferimento certificati, si decide di preparare una soluzione standard di nitrito (da usare come materiale standard interno) dissolvendo 0,2470 g di nitrito di sodio puro per analisi (99,9%) in 250 mL di acqua bidistillata. Dato che la soluzione deve essere usata nel corso delle misurazioni dell’esattezza, è necessario stimare l’incertezza della concentrazione di nitrito.

La concentrazione di nitrito è calcolata per mezzo dell’equazione:
Incertezza di misurazione: modello bottom-up La concentrazione di nitrito è calcolata per mezzo dell’equazione: dove mf (g), è la massa di nitrito più la massa della navicella di polipropilene usata per la sua pesata, m0 (g), è la massa della navicella MW (g/mole), è il peso molecolare del nitrito di sodio dedotto dalla Tavola dei pesi atomici standard IUPAC del 1989, V (L), è il volume di soluzione e infine P (%), è la purezza del nitrito di sodio utilizzato per la preparazione della soluzione standard. L’equazione permette di impostare i calcoli da eseguire per valutare anche l’incertezza del valore calcolato della molarità. La procedura, benché sia apparentemente semplice, richiede l’analisi delle diverse fonti di incertezza che contribuiscono all’incertezza del risultato finale. Esplicitare calcoli UOM

Diagramma causa-effetto relativo alla determinazione dell’incertezza della soluzione standard di nitrito. Esplicitare calcoli UOM

L’incertezza legata alla sensibilità della bilancia è trascurabile (la massa di nitrito viene determinata per differenza, utilizzando la stessa bilancia in un range ristretto di peso e in un breve intervallo di tempo), quindi il modello può essere semplificato. Esplicitare calcoli UOM

Le incertezze standard relative coinvolte sono: Volume : u(V)
Incertezza di misurazione: modello bottom-up Le incertezze standard relative coinvolte sono: Volume : u(V) calibrazione, u(Vc) ripetibilità, u(Vr) temperatura, u(Vt) Purezza : u(P) Peso molecolare : u(MW) ossigeno, u(AWO) sodio, u(AWNa) azoto, u(AWN) Massa [(navicella + nitrito) – (navicella)]: u(M) ripetibilità, u(Mr) calibrazione (linearità): u(Mc) Esplicitare calcoli UOM 133 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

e l’incertezza standard combinata assoluta:
Incertezza di misurazione: modello bottom-up È possibile ora calcolare l’incertezza tipo composta relativa della molarità: e l’incertezza standard combinata assoluta: Per scegliere il fattore di copertura corretto, t(1-/2),, si decide di combinare i gradi di libertà, i, delle singole componenti u(xi) mediante l’approssimazione di Welch-Satterthwaite. Esplicitare calcoli UOM 134 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

I gradi di libertà delle incertezze componenti delle cause principali (massa, volume, peso molecolare e purezza) sono : Esplicitare calcoli UOM 135 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Combinando i gradi di libertà delle incertezze componenti delle cause principali si ottiene infine: Nell’equazione sopra, in pratica, anche V  677, può essere considerato uguale a infinito. Considerato il risultato finale, tot  40, si può concludere che l’approssimazione di Welch-Satterthwaite, nel caso dell’esempio trattato, non porta a correzioni significative del fattore di copertura suggerito. Quindi, per un livello di fiducia del 95% è possibile usare k = 2, e la concentrazione della soluzione standard di nitrito risulta esprimibile come segue: Esplicitare calcoli UOM 136 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Il modello bottom-up è oggetto di numerose critiche, inerenti prevalentemente la sua applicabilità reale. Alcune tra le più qualificate, sono riportate nel recente lavoro R.G.Visser Measurement uncertainty: Opinions of the Government, The Accreditation Council and the Candidate accredited laboratory Accred. Qual. Assur., 7 (2002) 124 inerente i risultati del lavoro di quattro gruppi di studio incaricati da EURACHEM (nel meeting generale del 2000) di valutare problemi e soluzioni della stima dell’incertezza di misurazione dei metodi chimico-analitici. 137 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Da R.G.Visser, Accred. Qual. Assur., 7 (2002) 124 Conclusioni del gruppo di lavoro sugli alimenti (coordinato da R. Herber – Coronel Institute of the Analytical Medical Center of Amsterdam), incaricato di studiare la determinazione del deossinivalenolo nel grano mediante GC-FID, dei pesticidi nel latte mediante GC-ECD, della sostanza grassa nella polvere di latte mediante gravimetria e della conta batterica totale aerobica nel latte mediante tecniche microbiologiche. Le incertezze stimate erano in ogni caso inferiori a quelle stimate dalla riproducibilità. … L’incertezza poteva essere stimata più affidabilmente per mezzo di studi del recupero. I problemi principali derivavano dalla variabilità delle matrici, dalle interferenze, dalle derive strumentali, dalle disomogeneità e dall’instabilità dei campioni. La conclusione del gruppo di lavoro è stata che tutte le incertezze stimate avevano solo validità limitata. 138 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Da R.G.Visser, Accred. Qual. Assur., 7 (2002) 124 Conclusioni del gruppo farmacologico di lavoro (coordinato da G. Overvliet, Laboratory for the Quality Control of Medicines of RIVM, Bilthoven), incaricato di studiare la misurazione del pH in accordo con European Pharmacopoeia, la determinazione HPLC del del tartrato di alimemazina* negli sciroppi, la purezza dell’immunoglobulina in accordo a European Pharmacopoeia, l’acqua mediante KF, ed altro. Le incertezze stimate dai dati di validazione potevano essere usate con successo solo nel caso in cui lo studio di validazione avesse portato alla valutazione di tutte le incertezze componenti e, comunque, le incertezze stimate avrebbero dovuto essere verificate nell’ambito di studi interlaboratori. * Antistaminico 139 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Da R.G.Visser, Accred. Qual. Assur., 7 (2002) 124 Conclusioni del gruppo ambientale di lavoro incaricato di valutare le incertezze inerenti la determinazione dei metalli nei suoli mediante mineralizzazione acida e ICP (coordinato da J. Vuik, Royal Haskoning, Rotterdam). Nel caso del rame, il gruppo aveva tentato di usare il modello bottom-up classico, usando la GUM e la EURACHEM Guide. … Non era stato possibile quantificare tutte e 43 le sorgenti di errore, né quantificare le correzioni ad esse inerenti. Ulteriori studi su campioni reali avevano dimostrato, al variare dei campioni analizzati, variazioni dell’incertezza di misurazione dello stesso metallo comprese tra il 5% ed il 90%. Il gruppo ha concluso che il modello bottom-up classico non porta a stime utili. 140 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Il gruppo ha concluso che tale stima era molto poco importante. …
Incertezza di misurazione: modello bottom-up Da R.G.Visser, Accred. Qual. Assur., 7 (2002) 124 Conclusioni del gruppo petrolchimico di lavoro (coordinato da R.G. Visser, Institute of Interlaboratory Studies, Dordrecht), incaricato di valutare l’importanza della stima dell’incertezza per l’industria petrolifera. Il gruppo ha concluso che tale stima era molto poco importante. … Gli standard per l’uso dell’incertezza (quali ASTM 3244, IP367 e ISO4259) sono usati molto raramente. In caso di dispute, l’esecuzione di un’analisi di revisione avrebbe comunque permesso la risoluzione del caso senza la necessità di approfondire la comprensione della statistica inerente la dichiarazione dell’incertezza. 141 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Da R.G.Visser, Accred. Qual. Assur., 7 (2002) 124 Riassumendo i risultati presentati nelle relazioni dei quattro gruppi di lavoro, si può concludere che non è probabile che l’approccio classico bottom-up rappresenti per i chimici analitici uno strumento utile alla stima dell’incertezza. … Tutti i gruppi hanno convenuto che i dati disponibili da studi di validazione (da metodi standard, studi interlaboratori o studi intralaboratorio) permettono stime ragionevoli dell’incertezza di misurazione (con l’eccezione di casi particolari di disomogeneità del campione). 142 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

In un recente lavoro* è stato ribadito quanto segue:
Incertezza di misurazione: approccio bottom-up In un recente lavoro* è stato ribadito quanto segue: The first edition of the EURACHEM Guide for ‘Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement’ insisted very much on the component-by-component approach and, in this way, has caused unnecessary confusion. The second edition follows closely a document prepared by IUPAC, AOAC, FAO and IAEA and stresses to a much larger extent that «Measurement uncertainty must be integrated with its existing quality assurance measurements, with these measures themselves providing much of the information required to evaluate the measurement uncertainty». In its draft version, it goes on to say that «It attempts to correct the impression gained within the Analytical Community that it is only the so-called component-by-component approach that is acceptable ... ». The final version refers to the ISO guide 17025, which also allows one the use of approaches for the uncertainty evaluation other than the component-by-component approach. The second edition of the EURACHEM guide is a very useful document - much more so than the first one. It is, however, somewhat unfortunate that the examples cited give much more room to the component-by-component approach than to those based on method validation data. * E. Hund, D.L. Massart, J. Smeyers-Verbeke,Operational definitions of uncertainty, TRAC., 20 (2001) 394 143 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

MODELLO TOP-DOWN SEMPLIFICATO
Incertezza di misurazione: approccio top-down MODELLO TOP-DOWN SEMPLIFICATO Uno dei modelli alternativi, noto come modello top-down, è stato proposto dall’Analytical Methods Committee della Royal Society of Chemistry*. Il modello top-down considera il laboratorio da un più alto livello, come membro di una popolazione di laboratori. Allora gli errori casuali e sistematici all’interno del laboratorio, visti da questo livello, diventano errori casuali tra i vari laboratori (randomizzazione degli errori sistematici) e come tali possono essere valutati usando tecniche statistiche abbastanza semplici. * Analytical Methods Committee, Uncertainty of measurement: Implications of its use in Analytical Science, Analyst, 120 (1995) 2303 144 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Incertezza di misurazione: approccio top-down
Quando un campione omogeneo è analizzato da N laboratori mediante una certa procedura, il risultato ottenuto da ciascun laboratorio può essere espresso come segue: dove x è il risultato ottenuto,  il valore vero, metodo l’errore sistematico del metodo, lab l’errore sistematico laboratorio, co l’errore sistematico della corsa (run) ossia derivante dalle condizioni operative (giorno, operatore, ecc.) ed  l’errore casuale. Normalmente  non è noto. Nel modello top-down,  è sostituito dal valore vero convenzionale, xm, ovvero dalla media delle medie ottenute dagli N laboratori coinvolti nello studio. 145 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Inoltre, il bias del laboratorio e quello della corsa diventano variabili casuali alle quali può essere associata una varianza. L’unico errore sistematico rimasto è il bias del metodo. Poiché l’incertezza deve comprendere tutti i fattori che influenzano il risultato analitico (sia gli errori casuali che sistematici) si ha dove il valore indicato di t (a 2 code) è calcolato, preferibilmente*, mediante l’approssimazione di Welch-Satterthwaite e gli altri simboli hanno un ovvio significato. * In caso contrario si usi il solito k = 2 ( = 0,05) o k = 2.6 ( = 0,01) 146 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Tutte le varianze nell’equazione precedente, salvo quella legata all’incertezza del metodo, possono essere stimate dai risultati della prova interlaboratori. L’incertezza del metodo, umetodo, deve tener conto dell’incertezza del valore certificato del CRM. Infatti, dato che il bias del metodo, visto da questo livello superiore, è il solo errore sistematico, si ha e dove N è il numero di laboratori partecipanti alla prova e (s2metodo/N) rappresenta la varianza della media dei risultati ottenuti dagli N laboratori (la varianza della grande media). 147 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Secondo un noto esperto del settore*
Incertezza di misurazione: approccio top-down Secondo un noto esperto del settore* …The primary advantage of this methodology is that it is based on estimates from actual laboratory measurements, not from expert guesstimates and budget allowances. Tuttavia, anche il modello top-down è stato oggetto di critiche. Infatti, considerata la varietà dei problemi analitici possibili, non è sempre facile reperire un numero adeguato di laboratori interessati a partecipare ad un opportuno studio interlaboratorio. Inoltre, l’incertezza stimata non include i contributi del campionamento, dei possibili pretrattamenti di omogeneizzazione dei campioni e delle differenze tra la composizione della matrice usata per lo studio interlaboratori e quella dei campioni usati nelle misurazioni reali. W. Horwitz, R. Albert, The Concept of Uncertainty as Applied to Chemical Measurements, Analyst, 122 (1997) 615) 148 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Incertezza di misurazione: approccio NMKL
MODELLO NMKL Secondo il Nordic Committee on Food Analysis* (NMKL) il modello bottom-up è più adatto a misurazioni fisiche che a misurazioni chimiche. NMKL ha quindi sviluppato procedure alternative che hanno trovato particolare applicazione nel campo delle analisi chimiche degli alimenti. Confrontato con il modello bottom-up, quello NMKL è molto più semplice, e nello stesso tempo fornisce una vista d’insieme dell’incertezza dell’intero processo analitico. L’approccio è basato su dati sperimentali generati all’interno del laboratorio. Non vengono utilizzati dati relativi alla precisione interlaboratori raccolti per mezzo di studi collaborativi. In questo modo l’incertezza di misurazione stimata è applicabile solo agli errori casuali dello stesso laboratorio. NMKL: Nordisk Metodik Komité for Levnedsmidler (in danese). NMKL è un organizzazione nordeuropea di analisti alimentari, microbiologi, chimici e analisti sensoriali. Fondata nel 1947 ho come obiettivo fondamentale la selezione, la validazione, l’approvazione e la pubblicazione di metodi di analisi degli alimenti. I parametri di qualità sono valutati inizialmente nel corso di studi collaborativi, organizzati da NMKL o altre istituzioni. Più recentemente i programmi NMKL sono stati integrati da procedure e linee guida inerenti il controllo di qualità. * NMKL: Nordisk Metodik Komité for Levnedsmidler: organizzazione nordeuropea di analisti alimentari, microbiologi, chimici e analisti sensoriali avente come obiettivo fondamentale la selezione, la validazione, l’approvazione e la pubblicazione di metodi di analisi degli alimenti. 149 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Le procedure proposte sono applicabili ai campioni dal momento in cui arrivano al laboratorio: non sono considerati i possibili contributi all’incertezza dovuti al campionamento. Si presuppone inoltre che siano assenti errori sistematici. In caso contrario i risultati devono essere corretti adeguatamente. Viene suggerito inoltre di stimare il recupero, anche se viene sottolineata la necessità di interpretare con cautela (in modo conservativo) i risultati. La procedura è differente nel caso si disponga di campioni reali o materiali di riferimento stabili o meno nel tempo (Procedura A e, rispettivamente, B). Nel caso di materiali non stabili (Procedura B), si raccomanda di eseguire il controllo di qualità interno mediante verifica del mantenimento delle condizioni di controllo statistico (per mezzo di opportune carte di controllo). NMKL: Nordisk Metodik Komité for Levnedsmidler (in danese). NMKL è un organizzazione nordeuropea di analisti alimentari, microbiologi, chimici e analisti sensoriali. Fondata nel 1947 ho come obiettivo fondamentale la selezione, la validazione, l’approvazione e la pubblicazione di metodi di analisi degli alimenti. I parametri di qualità sono valutati inizialmente nel corso di studi collaborativi, organizzati da NMKL o altre istituzioni. Più recentemente i programmi NMKL sono stati integrati da procedure e linee guida inerenti il controllo di qualità. 150 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

(i simboli hanno il loro significato usuale)
Incertezza di misurazione: approccio NMKL Procedura A (condizioni di precisione intermedia – riproducibilità interna): eseguire 10 analisi replicate su un campione reale, o materiale di riferimento certificato, o materiale di riferimento interno, in tempi diversi; se necessario ripetere a diversi livelli di concentrazione (basso, medio e alto). Se le misurazioni sono relative alla verifica di un limite legale o composizionale, ripetere ad un livello di concentrazione simile al valore limite; se necessario ripetere su diverse matrici) calcolare sR e RSDR (i simboli hanno il loro significato usuale) stimare l’incertezza come segue Come sempre, l’uso di k = 2 associa all’incertezza il livello di fiducia del 95%. Al fine di rendere possibile la stima dell’incertezza, deve essere definito un parametro che descriva l’intervallo di incertezza. Il parametro consigliato in questo caso è la “deviazione standard della riproducibilità interna”, calcolabile dai dati analitici ottenuti in condizioni di riproducibilità interna. Un prerequisito del modello NMKL è la stabilità del materiale nel tempo, in modo da poter analizzare i campioni in un range di tempo piuttosto ampio. Tuttavia, nel caso in cui non si disponga di materiali di riferimento adatti allo scopo (per esempio perché l’analita è instabile), il modello NMKL suggerisce una procedura alternativa basata sull’elaborazione dei risultati di analisi condotte in doppio. Converrebbe notare, a questo punto, che essendo le determinazioni state eseguite in doppio, in tempi differenti su materiali che contengono l’analita in concentrazione simile, e da parte di analisti differenti, sia più corretto parlare di deviazione standard della precisione intermedia invece che di deviazione standard della ripetibilità. D’altra parte, l’esecuzione delle analisi da parte di diversi analisti è importante al fine di non sottostimare l’incertezza di misurazione che, in queste condizioni si avvicinerà maggiormente a quella stimabile in condizioni di riproducibilità. Il modello implica inoltre che nel caso che la deviazione standard della ripetibilità vari con la concentrazione di analita, essa deve essere stimata usando materiali che coprano diversi valori di concentrazione. Si raccomanda di eseguire un controllo di qualità interno con l’aiuto di carte di controllo basate sulla differenza tra i risultati di misurazioni duplicate (carta-R o carta delle differenze). 151 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

ESEMPIO N. 23 – Nel corso dello sviluppo di un metodo HPLC per la determinazione del colesterolo totale nel siero di sangue umano si desidera stimare l’incertezza di misurazione. Allo scopo viene acquisito il materiale di riferimento SRM1951a (Level II), contenente 7,1554 mmol/L di colesterolo in siero umano. Il materiale viene analizzato ripetutamente nello stesso laboratorio, su un arco di due settimane, da due diversi analisti utilizzanti due strumenti diversi. I risultati ottenuti (mmol/L) sono i seguenti: Analista 1: 7,0015; 7,2117; 6,6903; 7,4848; 6,7900; Analista 2: 7,5005; 7,3000; 7,6990; 6,9511; 7,3303. Stimare l’incertezza di misurazione applicabile a campioni reali contenenti 5,8900 e 8,0507 mmol/L (P = 95%). 152 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Il valore medio, la deviazione standard e la deviazione standard relativa della riproducibilità interna, calcolati utilizzando i dieci risultati, risultano uguali a Cmedio = 7,1959 mmol/L s = 0,3294 mmol/L RSDR = 0,04578 L’incertezza di misurazione alle due concentrazioni risulta pertanto uguale a : UOM5,8900 = 0,04578·5,8900·2 = 0,5393 mmol/L pertanto C = 5,89  0,54 mmol/L UOM8,0507 = 0,04578·8,050·2 = 0,7371 mmol/L pertanto C = 8,05  0,74 mmol/L Si noti che nelle condizioni reali di lavoro del laboratorio, i risultati devono essere arrotondati alla seconda cifra decimale (seconda cifra significativa dell’incertezza). Si noti la differenza tra l’uso di t = (usato per calcolare l’intervallo di fiducia per P= 95% e n = 10) e k = 2 (usato al posto di 1,96 per trasformare la RSDI in incertezza di misurazione (P è ancora uguale a 95%). Questo perché il modello NMKL raccomanda l’uso del fattore di copertura k = 2. 153 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Procedura B (condizioni di ripetibilità):
Incertezza di misurazione: approccio NMKL Procedura B (condizioni di ripetibilità): eseguire 10 analisi in doppio (ai e bi) su campioni reali contenenti approssimativamente la stessa concentrazione di analita (se necessario, eseguirle in tempi diversi e/o usando diversi analisti); se necessario, ripetere a diversi livelli di concentrazione - basso, medio e alto; se le misurazioni sono relative alla verifica di un limite legale o composizionale, ripetere ad un livello di concentrazione simile al valore limite; se necessario ripetere su diverse matrici; calcolare RSDR: stimare l’incertezza alla concentrazione Cx come segue Come sempre, l’uso di k = 2 associa all’incertezza il livello di fiducia del 95%. Si raccomanda di eseguire un controllo di qualità interno con l’aiuto di carte di controllo basate sulla differenza tra i risultati di misurazioni duplicate (carta-R o carta delle differenze). 154 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Determinazione N. Data a b 1 04.05.01 100,0 105,1 2 05.05.01 87,9 93,2
Incertezza di misurazione: approccio NMKL ESEMPIO N. 24 – Valutare l’UOM dai risultati delle seguenti misurazioni dei carboidrati totali (mg/100g, prevalentemente lattosio) eseguite in doppio su campioni di formaggio Lancashire (P = 95%). Determinazione N. Data a b , ,1 , ,2 , ,2 , ,5 , ,8 , ,9 , ,3 , ,3 , ,3 , ,8 NMKL: Nordisk Metodik Komité for Levnedsmidler (in danese) NMKL è un organizzazione nordeuropea di analisti alimentari, microbiologi, chimici e analisti sensoriali. Fondata nel 1947 ho come obiettivo fondamentale la selezione, la validazione, l’approvazione e la pubblicazione di metodi di analisi degli alimenti. I parametri di qualità sono valutati inizialmente nel corso di studi collaborativi, organizzati da NMKL o altre istituzioni. Più recentemente i programmi NMKL sono stati integrati da procedure e linee guida inerenti il controllo di qualità.. 155 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

La deviazione standard relativa
Incertezza di misurazione: approccio NMKL La deviazione standard relativa delle riproducibilità risulta uguale a: Pertanto, se la concentrazione misurata di un campione è Cx = mg/100g, il risultato risulta affetto dall’incertezza U = 2·RSDR·Cx, ovvero U = 7,3374 mg/100g e deve essere scritto come segue: C = 95,2  7,3 mg/100g (P = 95%) Se invece Cx = 105,36 mg/100g, allora l’incertezza è U = 8,1205 mg/100g ed il risultato è: C = 105,4  8,1 mg/100g (P = 95%) NMKL: Nordisk Metodik Komité for Levnedsmidler (in danese) NMKL è un organizzazione nordeuropea di analisti alimentari, microbiologi, chimici e analisti sensoriali. Fondata nel 1947 ho come obiettivo fondamentale la selezione, la validazione, l’approvazione e la pubblicazione di metodi di analisi degli alimenti. I parametri di qualità sono valutati inizialmente nel corso di studi collaborativi, organizzati da NMKL o altre istituzioni. Più recentemente i programmi NMKL sono stati integrati da procedure e linee guida inerenti il controllo di qualità.. 156 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Incertezza di misurazione (equazione di Horwitz)
Una valutazione approssimata dell’incertezza di misurazione, così come determinata dall’attuale livello tecnologico delle misurazioni analitiche, è fornita dall’equazione di Horwitz. L’equazione, ricavata analizzando circa set di risultati relativi a misurazioni interlaboratorio (US-FDA), permette di stimare la RSD percentuale assegnabile ad un risultato analitico sulla base della sola concentrazione (a prescindere dal tipo di analita, matrice e strumentazione). Il valore di RSD% ricavato dall’equazione di Horwitz è indicativo, e può essere corretto. Nel caso di misurazioni eseguite all’interno del laboratorio (in condizioni di ripetibilità) il risultato può essere ridotto al 65%, mentre nei test di confronto dei risultati ottenuti tra diversi laboratori (in condizioni di riproducibilità) esso può essere raddoppiato. L’equazione di Horwitz permette di verificare l’attendibilità dell’eventuale UOM stimata per altra via. 157 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Se C = 0.5, ovvero C = 50%, si ottiene RSDth = 2,2%.
Incertezza di misurazione (equazione di Horwitz Se C = 0.5, ovvero C = 50%, si ottiene RSDth = 2,2%. Se invece C = 10-9, ovvero C è a livello di ppb, si ottiene RSDth = 45%. Se C = 10-9 ma le analisi sono eseguite in condizioni di ripetibilità, RSDth può essere ridotta di circa un terzo (da 45% a 29–30%). In condizioni di riproducibilità, RSDth può essere aumentata fino a raddoppiare (da 45% a 90%). 158 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Il risultato dell’Esempio 24
Incertezza di misurazione (equazione di Horwitz A livello di 100mg/100g ovvero C = 10-3 (caso dei carboidrati dell’Esempio N. 24), l’equazione di Horwitz permette di stimare una RSD uguale al 5,7%. Dato che i risultati sono intralaboratorio, questo valore può essere ridotto fino al 60%, diventando uguale al 3,4%. Il risultato dell’Esempio 24 è in buon accordo con il valore prevedibile. Ovviamente, la stima più affidabile del l’incertezza di misurazione può essere ottenuta confrontando i risultati sperimentali con quelli ottenuti mediante uno o più dei modelli esistenti (il modello top-down, come già sottolineato, è il più applicato, anche se il lavoro necessario è più difficile da organizzare). 159 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Se U(C) = ± 0,10 mg/kg ( = 0,05;  = 3) Cmax = 1,90 mg/kg
Incertezza di misurazione ed espressione del risultato L’incertezza di misurazione è essenziale per confrontare i risultati tra di loro o con valori fissati da specifiche o norme. Ad esempio, si vuole verificare se la concentrazione di un certo analita in un materiale è conforme al valore limite massimo stabilito da una certa norma: VLA = 2,0 mg/kg. Il risultato dell’analisi è: Canalita = 1, mg/kg. Il materiale è conforme? LA RISPOSTA DIPENDE DALL’INCERTEZZA DI MISURAZIONE! Se U(C) = ± 0,10 mg/kg ( = 0,05;  = 3) Cmax = 1,90 mg/kg CONFORME Se U(C) = ± 0,33 mg/kg ( = 0,05;  = 3) Cmax = 2,13 mg/kg POTENZIALMENTE NON CONFORME 160 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Incertezza di misurazione ed espressione del risultato
Un esempio di considerazione dell’UOM nella valutazione della conformità a limiti legali viene dall’Inghilterra, dove il risultato della misurazione della concentrazione dell’alcol nel sangue delle persone accusate di guida in stato di ubriachezza è normalmente presentato al Tribunale come prova. Il limite legale del tasso alcolico nel sangue, superato il quale l’imputato è dichiarato colpevole, è 80 mg/100mL. Il Laboratory of Government Chemist* ha determinato l’incertezza associabile alla misurazione: U = 2 mg/100 mL. Quindi un valore di 81 mg/mL, apparentemente superiore al limite legale, potrebbe rappresentare un valore reale compreso tra 79 mg/100mL e 83 mg/100mL. In realtà, nel caso di contestazioni di guida in stato di ebbrezza, per convenzione generalmente adottata in UK, l’analista sottrae 6 mg/100 mL (non 2 mg/100 mL) dal valore determinato al fine di considerare opportunamente l’effetto dell’UOM. * R. Treble, Analytical measurement and the Law, VAM Bulletin N. 20, Spring 1999, p. 3 161 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

L’incertezza di misurazione è essenziale anche al fine di decidere il numero di cifre significative di un risultato. Infatti, questo deve essere arrotondato alla prima o seconda cifra significativa dell’incertezza. La prima cifra significativa dell’incertezza corrisponde alla prima cifra incerta della media. 34,  0, = 34,1  0,3 u.m. … 162 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

5044,  20, =  21 u.m. … 0,  3, La seconda cifra significativa dell’incertezza corrisponde alla seconda cifra incerta della media. = 0,0  3,3 u.m. … 163 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Robustezza ROBUSTEZZA La robustezza è la misura della capacità di una procedura analitica di non essere alterata da piccole (deliberate) variazioni dei fattori (delle variabili) che possono prevedibilmente influenzarne i risultati. Conviene focalizzare l’attenzione sui fattori più influenti (critici), ordinandoli in base alla loro influenza sulle prestazioni del metodo, e stabilire procedure di controllo di qualità per mantenerli sotto controllo. La procedura per valutare la robustezza implica il confronto sistematico degli effetti delle variazioni dei fattori d’influenza sul risultato dell’analisi. Nel caso di un numero limitato di fattori (al massimo tre) si può valutare la robustezza confrontando i risultati medi ottenuti prima e dopo una loro variazione arbitraria. I livelli di fattore da esaminare derivano dalle specifiche del metodo in esame, dettagliate nella SOP di validazione. È evidente che le prestazioni di un metodo validato non devono essere influenzate da variazioni di livello comprese nei limiti specificati nella SOP di validazione (per esempio, pH = 4,7 (± 0,1)). 164 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Robustezza Nel caso di un numero maggiore di variabili d’influenza si può usare il metodo di Youden. Questi ha dimostrato che sono sufficienti 8 misurazioni per valutare l'effetto delle variazioni imposte deliberatamente a 7 fattori d’influenza. Il metodo implica la scelta, per ciascun fattore, di due livelli, più alto e, rispettivamente, più basso del valore standard di ciascuno dei fattori critici. Indicando con a+, b+, c+, d+, e+, f+, g+ i livelli alti e con a-, b-, c-, d-, e-, f-, g- i livelli bassi, è possibile progettare 8 misurazioni, una per ogni combinazione, CP, di fattori. Queste combinazioni sono presentate nello schema sottostante: Fattori Risultati Cp a b c d e f g r1 r2 r3 r4 r5 r6 r7 r8 Teoricamente, sarebbero necessarie 27 = 128 prove indipendenti per esaminare gli effetti di tutte le possibili combinazioni. Invece, è sufficiente selezionare un sottoinsieme di 8 prove predisposte come in Tabella 1C per ottenere lo scopo voluto. 165 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Robustezza Usando gli otto risultati, è possibile calcolare l'effetto prodotto dalle variazioni imposte a ciascun fattore come differenza, in valore assoluto, fra la media dei 4 risultati delle prove eseguite mantenendo questo fattore al livello alto e la media dei 4 risultati delle prove eseguite mantenendo lo stesso fattore al livello basso (Va, Vb, …) . L’esame dei valori assoluti di ciascuna prova permette di verificare la robustezza del metodo verso i fattori esplorati. Se le variazioni di un fattore influenzano il risultato dell’analisi più di quelle di altri fattori, allora la differenza ad esso relativa risulterà maggiore delle altre. 166 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

il calcolo del valore sperimentale
Robustezza Per valutare se questa differenza più elevata delle altre ha un effetto significativo sul risultato, si può eseguire un test di significatività. Questo implica: la stima della ripetibilità del metodo, come deviazione standard stimata da N analisi replicate di un campione rappresentativo in un intervallo temporale ristretto; il calcolo del valore sperimentale dove Vi è la differenza relativa al fattore iesimo, n è il numero di esperimenti condotti ad ogni livello per ogni parametro (4 nel caso del disegno di Youden), ed s è la stima della precisione del metodo calcolata al punto 1; il confronto del valore ottenuto con quello critico a 2 code per il livello di fiducia prescelto e N-1 gradi di libertà: se il valore ottenuto è maggiore di quello critico, la differenza iesima è significativamente diversa da zero: la variazione del fattore ha avuto un effetto significativo sulle prestazioni del metodo. 167 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Le condizioni operative standard (livelli standard) sono le seguenti:
Robustezza ESEMPIO N. 25 – I fattori che più probabilmente possono influire sui risultati della determinazione del nitrito nelle acque mediante spettrofotometria VIS (metodo di Griess) sono il pH della soluzione (a), il tempo di conservazione del campione (b), la temperatura di lavoro (c), la lunghezza d’onda (d), il tempo atteso perché la reazione vada a completamento (e). Avendo identificato solo cinque fattori, per poter applicare il metodo di Youden si decide di considerare due fattori aggiuntivi fittizi, (f) e (g) (vedere testo a lato). Le condizioni operative standard (livelli standard) sono le seguenti: a = 1,5; b = 20°C; c = 20’; d = 534 nm; e = 30’ ; f = -; g = -; Le variazioni di livello dei fattori sono le seguenti: a+= 2,0; b+ = 25°C; c+ = 25’; d+ = 536 nm; e+ = 10’; f + = -; g+ = -; a- = 1,0; b- = 15°C; c- = 15’; d- = 532 nm; e- = 40’; f- = -; g- = -. La deviazione standard della ripetibilità in condizioni standard, a concentrazioni dell’ordine di M, è risultata 0,015 ( = 9; unità di assorbanza). I risultati delle 8 prove (unità di assorbanza) sono i seguenti: r1 = 0,995; r2 = 0,981; r3 = 0,989; r4= 0,976 ; r5 = 0,954; r6 = 0,964; r7 = 0,950; r8 = 0,965 ; Valutare i fattori più influenti (P = 95%). 168 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Robustezza I risultati suggeriscono che i due fattori più influenti sono i fattori a ed e (pH e tempo di reazione). Per valutare in modo più affidabile l’influenza dei fattori sul risultato, si possono eseguire gli opportuni test di significatività. 169 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Robustezza I test forniscono i risultati a lato. Le differenze Va e Ve risultano maggiori del valore critico, t1-/2,9 = 2,26. Pertanto le prestazioni del metodo in esame sono significativamente influenzate da variazioni di pH e di tempo di reazione dell’ordine di quelle arbitrariamente apportate. Ovviamente, non sono riscontrate variazioni delle prestazioni associabili ai due fattori fittizi (g ed f). La rivalutazione della robustezza dopo aver ridotto le variazioni di livello dei due fattori a ed e, permetterà di definire le massime variazioni di livello ammissibili. 170 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Recupero RECUPERO Il recupero è la frazione di analita, presente o aggiunto alla porzione di materiale in prova, estratto e oggetto di misurazione. In teoria, tanto più il recupero è diverso dal 100%, tanto più sono probabili problemi. In pratica, il recupero dipende dalla concentrazione di analita. In base a quanto specificato dal manuale AOAC per il Peer Verified Methods program, al diminuire della concentrazione di analita è ragionevole ottenere recuperi sempre più diversi dal 100%, come indicato qui sotto. Analita% Frazione Concentrazione Recupero medio (%) %  %  % 0, ,1 % 0, mg/kg 0, mg/kg 0, mg/kg 0, g/kg 0, g/kg 0, g/kg 171 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Recupero La dipendenza dei valori accettabili del recupero da matrice, procedura analitica e concentrazione dell’analita, è sottolineata anche nel documento EC SANCO/3030/99 - rev /07/00 *. % Principio Recupero % Impurezze Recupero Attivo medio(%) medio (%) > > , < < 0, 0,01 – 0, < 0, * Technical material and preparations: Guidance for generating and reporting methods of analysis in support of pre- and post-registration data requirements for Annex II (Part A, Section 4) and Annex III (part A, Section 5) of Directive 91/414. La Direttiva 91/414/CEE è relativa all'immissione in commercio di prodotti fitosanitari. 172 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Il recupero può essere valutato:
mediante analisi di un materiale di riferimento certificato (procedura A); mediante fortificazione di un bianco (procedura B); mediante fortificazione di una matrice contenente l’analita (procedura C); mediante confronto dei risultati ottenuti con un metodo standard (procedura D). Le procedure B e C possono essere eseguite fortificando individualmente più aliquote del campione (B1 e C1) o analizzando più aliquote prelevate da un campione massivo fortificato (B2 e C2) . La procedura C deve essere seguita quando non esiste un bianco in cui l’analita è effettivamente assente. L’incertezza del recupero deve essere considerata insieme alle altre incertezze d’ingresso. Il calcolo del recupero e della relativa incertezza dipende dal metodo adottato. Inserire riferimento 173 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

calcolare l’incertezza del recupero, u(Rm), per mezzo dell’equazione
Procedura A: analizzare N (possibilmente almeno 10) aliquote prelevate da un CRM (matrice e livello di concentrazione, CCRM, il più possibile simili a quelli dei campioni reali), se possibile in condizioni di ripetibilità; calcolare il recupero medio, Rm, o il recupero medio percentuale, Rm%, per mezzo dell’equazione calcolare l’incertezza del recupero, u(Rm), per mezzo dell’equazione Inserire riferimento 174 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Il risultato è CHg = 10.21  0,44 mg/kg ( = 0.05;  = 5).
Recupero ESEMPIO N. 26 – Si desidera valutare il recupero di un metodo di analisi del mercurio in campioni di capelli mediante AAS. Allo scopo sono eseguite sei analisi replicate di un materiale di riferimento certificato (BCR CRM397, elementi in tracce in capelli umani) contenente la concentrazione di mercurio CHg = 12.3 mg/kg. Il risultato è CHg =  0,44 mg/kg ( = 0.05;  = 5). Il recupero percentuale risulta uguale a: A questi livelli di concentrazione il risultato è accettabile. Infatti l’AOAC ammette un recupero del %. 175 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

calcolare il recupero medio, Rm, per mezzo dell’equazione
Procedura B1: eseguire N (possibilmente almeno 10) analisi replicate di aliquote del bianco dopo averle fortificate singolarmente con la stessa quantità, mspk, di analita (nell’intervallo di concentrazione di interesse); calcolare il recupero medio, Rm, per mezzo dell’equazione calcolare l’incertezza del recupero, u(Rm), per mezzo dell’equazione Inserire riferimento 176 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

analizzare N (possibilmente almeno 10) aliquote prelevate da un campione massivo di bianco fortificato con la concentrazione Cspk di analita (nell’intervallo di concentrazione di interesse); calcolare il recupero medio, Rm, per mezzo dell’equazione calcolare l’incertezza del recupero, u(Rm), per mezzo dell’equazione Procedura B2: Inserire riferimento 177 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

calcolare i recuperi, Ri, per mezzo dell’equazione
Recupero Procedura C1: analizzare N (possibilmente almeno 10) aliquote del campione reale massivo fortificate individualmente con la concentrazione Cspk(i) di analita; calcolare i recuperi, Ri, per mezzo dell’equazione calcolare il recupero medio per mezzo dell’equazione Inserire riferimento 178 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Procedura C1 (continua):
Recupero Procedura C1 (continua): calcolare l’incertezza del recupero mediante la formula che può essere semplificata a se u(Cspk(i)) << u(Coss(i)) e di u(Cnativo), se la deviazione standard delle Cspk(i) << della media dei valori di Cspk(i) e se le stime di u(Coss(i)) sono dello stesso ordine di grandezza. Inserire riferimento 179 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Procedura C2: analizzare N (possibilmente almeno 10) aliquote del campione reale massivo dopo fortificazione con la concentrazione Cspk di analita; calcolare il recupero medio, Rm, per mezzo dell’equazione calcolare l’incertezza del recupero, u(Rm), per mezzo dell’equazione Inserire riferimento 180 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Il recupero risulta uguale a:
ESEMPIO N. 27 – Si desidera valutare il recupero di un metodo di analisi del piombo in campioni di vino rosè mediante voltammetria di ridissoluzione anodica con impulsi differenziali (DPASV). Allo scopo, sono analizzate 10 aliquote di un campione commerciale fortificato con Cspk = 3,2 ng/g di piombo (tempo di equilibrazione*: 24 h). I risultati sono i seguenti: C(ng/g): 13,37; 14,11; 14,82; 12,43; 13,72, 14,90; 13,77; 13,71; 12,66; 15,33. Stimare il recupero medio e la sua incertezza sapendo che Cnativo = 10,6 ± 0,5 ng/g (: 0,05; : 9) e che u(Cspk)k=2 = 0,2 ng/g. * Vedere testo a lato Il recupero risulta uguale a: Media e deviazione standard delle 10 analisi sono, rispettivamente: Inserire riferimento 181 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

L’incertezza standard del recupero medio è uguale a:
L’incertezza standard dell’analita nativo è: L’incertezza del recupero è spesso una componente importante dell’incertezza standard combinata. Inserire riferimento 182 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Procedura D: analizzare almeno 5 volte un campione reale tipico con il metodo in esame e con un metodo standard di cui è nota l’incertezza di misura, u(Cstd); calcolare il recupero medio, Rm, per mezzo dell’equazione calcolare l’incertezza del recupero, u(Rm), per mezzo dell’equazione Inserire riferimento 183 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

allora l’incertezza composta del risultato corretto diventa
Recupero Per valutare se il recupero è significativamente differente dal 100% (o da 1) è possibile ricorrere ad un test-t. Allo scopo, il valore sperimentale ottenuto per mezzo dell’equazione deve essere confrontato con il valore critico di t (a due code) per l’appropriato livello di fiducia e gli appropriati gradi di libertà ( ). Se t risulta inferiore a t1-/2,, allora Rm non è significativamente diverso da 1 (o dal 100%). Se, al contrario, t risulta maggiore di t1-/2,, e quindi Rm è significativamente diverso da 1 (o dal 100%), e se il risultato dell’analisi è corretto per il recupero allora l’incertezza composta del risultato corretto diventa 184 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

L’incertezza corretta risulta uguale a
Recupero ESEMPIO N. 28 – Si desidera valutare l’incertezza di misurazione, corretta per il recupero, di un metodo per la determinazione degli ormoni nell’urina bovina. L’incertezza standard composta del metodo, a livelli di concentrazione dell’ordine di 12,8 g/L, è stata stimata uguale a ± 3,2 g/L. Allo scopo, il recupero viene stimato mediante analisi in doppio delle urine di 6 animali diversi per razza, provenienza, sesso ed età dopo opportuna fortificazione. Il recupero medio e la sua deviazione standard sono risultati uguali rispettivamente a 71% e 23%. Valutare l’incertezza composta corretta. L’incertezza corretta risulta uguale a La considerazione del recupero porta ad un aumento di circa il 60% dell’incertezza composta del risultato (e di quella estesa). 185 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Carte di controllo CARTE DI CONTROLLO Quando il metodo validato è usato per condurre il lavoro di routine, è necessario assicurarsi che i parametri di qualità stimati in precedenza valgano anche per i campioni reali, e che non peggiorino nel tempo. Allo scopo è necessario mantenere il sistema analitico sotto controllo statistico, ovvero assicurarsi che il sistema analitico sia caratterizzato da fluttuazioni solo casuali attorno ad un valore di riferimento e che queste fluttuazioni (quantificate in funzione di una deviazione standard) rimangano costanti. Nel laboratorio di prova e taratura, il monitoraggio della stabilità di una procedura analitica può essere eseguito mediante l’uso di uno strumento semplice ma estremamente potente, ovvero delle carte di controllo. La costruzione delle carte di controllo richiede la disponibilità di un materiale di controllo (CM). I CM possono essere materiali di riferimento certificati (situazione ottimale ma spesso non realizzabile), materiali preparati allo scopo dal laboratorio, bianchi o, in determinati casi, campioni reali, e devono essere disponibili in quantità sufficiente a permettere il prelievo e l’analisi di numerosi campioni di controllo (CS). La composizione complessiva ed il livello di concentrazione dell’analita nel materiale di controllo devono riflettere adeguatamente la natura chimica dei campioni reali da analizzare. Introdurre controllo statistico e carte di controllo. 186 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Carte di controllo Nel caso più semplice, i parametri utili alla definizione dei limiti di attenzione e di azione sono ricavati analizzando un numero adeguato di volte (almeno 15 – 20 volte) lo stesso campione di controllo. La carta viene quindi posta in uso. Allo scopo, i campioni di controllo devono essere inseriti in ordine casuale, all’interno dei campioni di ogni corsa (analitica). L’analisi del campione di controllo può essere eseguita in giorni diversi, o da operatori diversi, in modo da permettere la considerazione di eventuali derive temporali o della diversa manualità degli operatori. Introdurre controllo statistico e carte di controllo. 187 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

più di due analisi in doppio del CM per corsa
Carte di controllo A seconda delle necessità imposte dall’utilizzazione dei risultati delle misurazioni, si può decidere di eseguire, per esempio più di due analisi in doppio del CM per corsa un’analisi in doppio del CM per corsa un’analisi singola del CM per corsa Il risultato delle analisi dei CS deve essere immediatamente riportato sulla carta di controllo, e la sua accettabilità deve essere valutata in base ad opportune regole di controllo. Se il risultato dell’analisi del CS non può essere accettato, tutti i risultati relativi ai campioni reali analizzati nell’ambito della stessa corsa devono essere considerati potenzialmente errati e quindi rifiutati. Questi campioni devono essere rianalizzati dopo aver identificato le cause che hanno determinato il rifiuto del risultato del CS, ovvero dopo aver riportato il sistema analitico sotto controllo statistico. Dopo aver eseguito 10 – 15 corse, conviene ricalcolare parametri e limiti di controllo aggiungendo i nuovi risultati relativi al CS a quelli ottenuti nel corso della preparazione della carta. La nuova carta potrà essere quindi usata nelle analisi di routine. Introdurre controllo statistico e carte di controllo. 188 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Avendo eseguito le N misurazioni del CM si applicano le equazioni
Carta di Shewhart per risultati singoli Le carte di controllo più note sono le carte di Shewhart. La più semplice è quella per risultati singoli. Per costruirla, è necessario eseguire un numero adeguato di analisi del campione di controllo (N  20), calcolare il valore medio, µ, il range mobile medio e la deviazione standard, . Avendo eseguito le N misurazioni del CM si applicano le equazioni dove d2 è il fattore di correzione per il quale deve essere diviso il range mobile medio per ottenere . n 1/d2 0, , , , ,3249 I valori di 1/d2 sono tabulati in funzione del numero di analisi replicate del CM eseguite in ogni corsa, n, usate per valutare il range: L’uso del valore di  ottenuto dal range mobile al posto di quello calcolabile tradizionalmente (mediante la nota formula per il calcolo della deviazione standard) è giustificato dal fatto che in tal modo si minimizza ogni possibile deriva temporale. 189 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Il range mobile medio (n =2) risulta uguale a
Carta di Shewhart per risultati singoli ESEMPIO N. 29 – Stimare i parametri di controllo,  e , per la costruzione di una carta di Shewhart per risultati singoli. Allo scopo un campione di controllo viene analizzato 25 volte (N). I risultati (u.a.) sono i seguentI: x1: 25,15; x2: 25,01; x3: 24,92; x4: 25,37; x5: 25,00; x6: 25,01; x7: 24,94; x8: 25,31; x9: 24,94; x10: 24,94; x11: 25,11; x12: 25,28; x13: 25,00; x14: 24,87 x15: 25,05; x16: 24,98; x17: 25,06; x18: 24,80; x19: 25,32; x20: 25,17; x21:24,72; x22: 24,93; x23: 25,02; x24: 25,12; x25: 25,13. Il range mobile medio (n =2) risulta uguale a La deviazione standard risulta quindi uguale a Quella calcolata tradizionalmente sarebbe 190 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

µ+2: linea superiore di attenzione (UWL, upper warning line)
Carta di Shewhart per risultati singoli Sulla base dei parametri di controllo così stimati, è possibile disegnare la carta di controllo. Allo scopo sono riportati in grafico il valore medio e due coppie di linee a: µ+2: linea superiore di attenzione (UWL, upper warning line) µ-2 : linea inferiore di attenzione (LWL, lower warning line) µ+3: linea superiore di azione (UAL, upper action line) µ-3 : linea inferiore di azione (LAL, lower action line) Il grafico risultante è il seguente: 191 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Carta di Shewhart per risultati singoli
Regole di Westgard 12s : regola di attenzione che richiede un esame ulteriore dei dati quando una misura di controllo cade fuori dell’intervallo   2s. Infatti, esistono solo 5 probabilità su 100 che un valore misurato per un campione di controllo, analizzato durante una corsa analitica, esca dall'intervallo µ ± 2s. 13s : la serie viene rifiutata quando una misura di controllo cade fuori dell’intervallo   3s. Infatti, esistono solo 0,3 probabilità su 100 che un valore misurato per un campione di controllo, analizzato durante una corsa analitica, esca dall'intervallo µ ± 3s. J.O. Westgard, P.L. Barry, Cost-effective quality control: managing the quality and productivity of analytical processes, AACC Press, Washington, DC (1986) 192 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Esistono altre regole di Westgard:
Carta di Shewhart per risultati singoli Esistono altre regole di Westgard: 22s : la serie viene rifiutata quando due misure di controllo successive cadono fuori dell’intervallo   2s; R4s : la serie viene rifiutata quando la differenza tra due misure di controllo successive supera il valore di 4s; 41s : la serie viene rifiutata quando quattro misure di controllo successive cadono fuori dello stesso limite, +1s o –1s; 10xm : la serie viene rifiutata quando dieci misure di controllo successive cadono dalla stessa parte del valore medio. 193 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Schema decisionale adottato nel caso si scelga di applicare solo le prime due regole di Westgard (12s e 13s). Scegliendo solo le prime tre, si deciderà di rigettare la serie solo se un dato di controllo cade fuori dell’intervallo   3s o se 2 misure di controllo successive cadono fuori dell’intervallo   2s. 194 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Qualora si scelga di applicarle tutte, lo schema decisionale è invece questo. Scegliendo solo le prime tre, si deciderà di rigettare la serie solo se un dato di controllo cade fuori dell’intervallo   3s o se 2 misure di controllo successive cadono fuori dell’intervallo   2s. 195 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

In linea di principio, la carta di Shewhart per risultati singoli permette di evidenziare sia problemi di precisione che di bias, come evidenziato nella carta di Shewhart costruita con i seguenti risultati: 25,11; 24,80; 25,05; 24,75; 25,30; 25,15; 24,88; 25,00; 25,20; 24,95; 24,81; 24,28; 24,82; 24,65; 24,55; 24,80; 24,45; 24,27; 24,82; 24,73; 25,85; 25,11; 25,50; 24,12; 25,70; 24,22; 25,00; 24,28; 25,65. 196 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Carta di Shewhart delle medie
Se possibile, è meglio costruire la carta di Shewhart delle medie. In tal caso la media  usata nel caso della carta per risultati singoli deve essere sostituita dalla grande media (in cui k è il numero di analisi del CM eseguite per stimare ogni media). Per quanto riguarda la deviazione standard, esistono diverse possibilità: nel caso di misurazioni duplicate del CM è possibile stimare  tramite il range mobile medio (come nel caso della carta per misurazioni singole); dopo aver eseguito numerose misurazioni sul CM,  può essere stimata come deviazione standard raggruppata; più frequentemente viene suggerito di applicare il principio di additività della varianza e quindi di valutare  mediante la formula Inserire frase sul pericolo che software commerciali dividano per n invece che per n-a nel calcolo di spooled.e citare lavoro di Howart, Analyst 1995. ovvero come media delle deviazioni standard stimate dalle misure ottenute entro ciascuna corsa. 197 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

linea superiore di attenzione (UWL, upper warning line)
Carta di Shewhart delle medie La carta di controllo viene poi tracciata riportando in grafico la grande media e due coppie di linee: linea superiore di attenzione (UWL, upper warning line) linea inferiore di attenzione (LWL, lower warning line) linea superiore di azione (UAL, upper action line) linea inferiore di azione (LAL, lower action line) Scegliendo solo le prime tre, si deciderà di rigettare la serie solo se un dato di controllo cade fuori dell’intervallo   3s o se 2 misure di controllo successive cadono fuori dell’intervallo   2s. Insistere sul fatto che la definizione dei parametri per costruire la carta è critica al fine della sua utilità. Come già sottolineato, i limiti di controllo stabiliti nella fase iniziale del lavoro possono essere rivisti al termine del periodo iniziale di valutazione. Qualora il controllo statistico debba rispondere a criteri stringenti, conviene cancellare le medie che cadono al di fuori delle linee di azione e ridisegnare la carta di controllo usando i valori di  e  corretti. 198 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

La grande media è uguale a La deviazione standard, stimata come
Carta di Shewhart delle medie ESEMPIO N. 30 – Stimare i parametri di controllo,  e , per la costruzione di una carta di Shewhart delle medie. Allo scopo un campione di controllo viene analizzato 20 volte in doppio. I risultati medi (mg/L) delle 20 misurazioni in doppio sono i seguenti (tra parentesi le deviazioni standard corrispondenti): x1: 51,3 (1,5 ); x2: 50,1 (1,7); x3: 49,2 (1,3); x4: 53,9 (1,5); x5: 50,0 (2,1); x6: 50,1 (1,4); x7: 49,4 (1,5); x8: 53,8 (1,7); x9: 49,4 (2,2); x10: 49,4 (1,3); x11: 51,1 (1,5); x12: 52,8 (2,5); x13: 50,0 (2,2); x14: 48,7 (1,8) ; x15: 50,5 (1,8); x16: 49,8 (1,7); x17: 50,6 (2,5); x18: 47,0 (1,6); x19: 53,2 (1,9); x20: 51,7 (1,5). La grande media è uguale a La deviazione standard, stimata come radice quadrata della varianza media, risulta uguale a Scegliendo solo le prime tre, si deciderà di rigettare la serie solo se un dato di controllo cade fuori dell’intervallo   3s o se 2 misure di controllo successive cadono fuori dell’intervallo   2s. 199 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

La carta di Shewhart delle medie è riportata qui di seguito:
Scegliendo solo le prime tre, si deciderà di rigettare la serie solo se un dato di controllo cade fuori dell’intervallo   3s o se 2 misure di controllo successive cadono fuori dell’intervallo   2s. 200 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

La carta viene quindi usata nelle analisi di routine.
Carta di Shewhart delle medie La carta viene quindi usata nelle analisi di routine. Scegliendo solo le prime tre, si deciderà di rigettare la serie solo se un dato di controllo cade fuori dell’intervallo   3s o se 2 misure di controllo successive cadono fuori dell’intervallo   2s. Il risultato della 23a corsa è rifiutato. Dopo aver rimediato all’errore, il sistema ritorna in condizioni di controllo statistico. 201 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Si calcolano poi i limiti di attenzione e di azione:
Carta del range La carta-R o carta del range serve a mantenere sotto controllo la precisione. Per le applicazioni normali del laboratorio analitico, il range viene generalmente stimato come valore medio delle differenze assolute, Ri, tra i risultati di un numero adeguato di misurazioni replicate. Allo scopo, dopo aver eseguito N gruppi di n misurazioni replicate (n  2 in ogni gruppo) su campioni reali simili a quelli da analizzare, si valuta il range medio degli N range, Ri (differenza tra risultato maggiore e risultato minore delle n repliche eseguite in ciascun gruppo di misurazioni). Il range medio viene usato come linea centrale della carta. Si calcolano poi i limiti di attenzione e di azione: La carta di controllo del range, carta-R, serve a controllare la precisione, e quindi a verificare l’omogeneità della varianza nel tempo. Essa è particolarmente utile se costruita usando campioni reali. L’uso di materiali di riferimento quali CM è di scarsa utilità (è meglio usarli per costruire la carta della media). Citare Funk p. 93 202 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Fattori moltiplicativi del range medio per la costruzione di carte-R
Carta del range I valori utili dei fattori D per misurazioni in doppio* sono evidenziati sotto. La combinazione 95% - 99,7% è quella preferita in quanto corrisponde a quella usata nella carta di Shewhart (2s - 3s). Fattori moltiplicativi del range medio per la costruzione di carte-R n P=95% P=99% P=99,7% DLW DUW DLA DUA DLA DUA La carta di controllo del range, carta-R, serve a controllare la precisione, e quindi a verificare l’omogeneità della varianza nel tempo. Essa è particolarmente utile se costruita usando campioni reali. L’uso di materiali di riferimento quali CM è di scarsa utilità (è meglio usarli per costruire la carta della media). Citare Funk p. 93 * La scelta di n = 2 è quella più frequente in quanto è la meno onerosa. 203 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

CS1a.1…CS1a.n - S1.1 - S1.2 - S1.3 …S1.m - CS1b.1…CS1b.n
Carta del range Preparata la carta-R si passa alle operazioni su campioni reali. All’inizio di ogni corsa, si dichiara campione di controllo uno dei campioni reali da analizzare, e lo si analizza n volte all’inizio ed alla fine della serie di m analisi di campioni reali. I range del campione di controllo sono riportati sulla carta. CS1a.1…CS1a.n - S1.1 - S1.2 - S1.3 …S1.m - CS1b.1…CS1b.n Nel caso limite, il campione di controllo viene misurato all’inizio ed alla fine della corsa. La sequenza di analisi è quindi: CS1.1 - S1.1 - S1.2 - S1.3 …S1.m - CS1.2  CS2.1 - S2.1 - S2.2 – S2.3 … S2.m - CS2.2 ………. I range valutati dalle prove eseguite all’inizio ed alla fine della corsa sono riportati sulla carta-R. 204 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Il sistema è fuori controllo se:
Carta del range Il sistema è fuori controllo se: Ri giace sopra UAL (1) Ri giace sotto LAL (se LAL>0) 7 valori consecutivi di R mostrano un trend positivo o negativo (2) 7 valori consecutivi giacciono sopra il range medio (3) Il caso 4 è quello originato, per es., da invecchiamento dei reagenti o da interventi di manutenzione periodica: non indica situazioni fuori controllo! 205 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

I limiti di controllo possono essere calcolati
Carte delle differenze Per costruire la carta-D, il campione di controllo (simile ai campioni in esame) deve essere analizzato n volte (n  2) nel corso di ogni gruppo di analisi sui campioni reali. Le differenze tra l’ultimo ed il primo dei risultati delle analisi replicate relative al CM, eseguite in ogni gruppo di misurazioni, dovrebbero essere distribuite casualmente attorno allo zero. Nel caso di derive temporali, l’ultimo risultato sarà sempre maggiore (o sempre minore) del primo: i punti corrispondenti alle differenze calcolate analizzando i CM saranno localizzati prevalentemente sopra o sotto la linea di zero. I limiti di controllo possono essere calcolati dalla deviazione standard delle differenze limiti di attenzione: ± 2.sd limiti di azione: ± 3.sd dal range medio: limiti di attenzione: limiti di azione: La carta delle differenze richiede l’uso di materiali di controllo stabili! Nel caso siano usati campioni reali come CM, è essenziale verificare l’assenza di variazioni fisiche, chimiche o biologiche tra le n analisi di controllo successive. 206 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

I limiti di controllo utili per le due carte (P:95%
Carte di controllo ESEMPIO N. 31 – Nel corso dell’applicazione di un metodo FIA-PIF (Photoinduced Fluorescence detection) alla determinazione di pesticidi aromatici, si desidera verificare il mantenimento dello stato di controllo statistico. Il range medio, valutato mediante elaborazione dei risultati di 20 analisi in doppio di un campione contenente 3,8 mg/L di diflubenzuron (scelto come CM) è risultato uguale a 0,20 mg/L. I limiti di controllo utili per le due carte (P:95% e P: 99,7%) sono quindi uguali a: Durante il lavoro di routine, lo stesso campione reale usato come CM è analizzato in doppio, all’inizio (R1i) ed alla fine (R2i) di ogni corsa analitica; i risultati relativi alle 22 corse analitiche eseguite nelle prime due settimane di lavoro sono riportati qui a lato: Costruire la carta dei range e quella delle differenze. carta-R carta-D 207 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Carte di controllo La carta-R, riportata a sinistra, non evidenzia variazioni temporali della precisione: il range oscilla all’interno dell’intervallo di attenzione. La carta-D, riportata a destra, permette invece di rilevare una deriva positiva dei risultati a partire all’incirca dalla corsa N. 13 o N. 14: da questo punto in poi tutte le differenze sono positive. 208 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Test di tendenza di Neumann
Il test di tendenza di Neumann permette di verificare eventuali derive temporali dei risultati (per esempio dovute al deterioramento del MC durante la sua conservazione o all’invecchiamento di un detector). Il test richiede la disponibilità di un numero adeguato (N > 10) di misure successive del campione di controllo. Per eseguire il test deve essere calcolato il valore di Rexp In sostanza, Rexp è il rapporto tra la media quadratica delle N-1 differenze successive tra le N misure e la varianza delle misure stesse. Se Rexp è minore o uguale al valore critico tabulato per il numero di osservazioni e per un dato livello di significatività, R(N, ), si evidenzia una deriva temporale dei risultati. 209 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Il valore sperimentale di R è: Il valore critico è
Carte di controllo ESEMPIO N. 32 – Usando il test di tendenza di Neumann, verificare se le misure eseguite su di un CM, riportate a lato, sono caratterizzate da una deriva temporale sistematica ( = 0,01). Il valore sperimentale di R è: Il valore critico è R20;0,01 = 1,0406 (vedere la corrispondente Tavola statistica). Esiste una probabilità del 99% che le misure siano affette da deriva temporale. D’altra parte, il risultato risulta evidente anche dall’analisi grafica. 210 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

4 Valori critici di g (test di Cochran)
Tavole statistiche 1 Probabilità percentuale, P, e percentili, p, in funzione della variabile normale standardizzata, z. 2 Valori critici di t 3 Valori critici di F 4 Valori critici di g (test di Cochran) 5 Valori critici di Rexp (test di Neumann) 211 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Tavole statistiche Probabilità percentuale, P, e percentili, p, in funzione della variabile normale standardizzata, z. 212 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Valori critici di t1-, (1 coda)
Tavole statistiche  , , , , , , , ,  1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 30 40 50  Valori critici di t1-, (1 coda) Esempi::: 213 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Valori critici di t1-/2, (2 code)
Tavole statistiche  , , , , , , , ,  1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 30 40 50  Valori critici di t1-/2, (2 code) Esempi::: 214 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Valori critici di F (1 coda,  = 0,05)
Tavole statistiche N D 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Valori critici di F (1 coda,  = 0,05) 215 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Valori critici di F (1 coda,  = 0,01)
Tavole statistiche N D 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Valori critici di F (1 coda,  = 0,01) 216 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Valori critici di F (2 code ,  = 0,05)
Tavole statistiche N D 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Valori critici di F (2 code ,  = 0,05) 217 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Valori critici di F (2 code ,  = 0,01)
Tavole statistiche N D 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Valori critici di F (2 code ,  = 0,01) 218 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Valori critici di g per n misurazioni e k varianze ( = 0,05)
Tavole statistiche Valori critici di g per n misurazioni e k varianze ( = 0,05) 219 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Valori critici di g per n misurazioni e k varianze ( = 0,01)
Tavole statistiche Valori critici di g per n misurazioni e k varianze ( = 0,01) 220 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

Valori critici di Rexp (test di Neumann)
Tavole statistiche Valori critici di Rexp (test di Neumann) n/ 0, , , n/ , , ,05 221 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

ASSICURAZIONE DI QUALITÀ E VALIDAZIONE DEI METODI ANALITICI

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