Principi di Oncologia Sperimentale (2CFU) Dal 16 gennaio al 6 marzo Triennali Sc. Biologiche e Biotecnologie Oncologia Sperimentale di Laboratorio (3.

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1 Principi di Oncologia Sperimentale (2CFU) Dal 16 gennaio al 6 marzo Triennali Sc. Biologiche e Biotecnologie Oncologia Sperimentale di Laboratorio (3 CFU) Dal 16 gennaio al 3 aprile Magistrali tutte 1° S. BENINATI

2 LA PROLIFERAZIONE CELLULARE
- L’organizzazione multicellulare dipende da un programma di cooperazione delle cellule che compongono l’organismo. - La differenziazione tissutale segue un piano ben preciso. - In un organismo maturo le cellule sono limitate nella loro intrinseca spinta a moltiplicarsi a seconda dei loro territori, seguendo un preciso piano di sviluppo. - Questo meccanismo dipende dalla comunicazione tra le cellule, in modo che ogni cellula che occupa il suo posto specifico possa collaborare nel piano di sviluppo e di moltiplicazione secondo l’economia dell’organismo.

3 Proliferazione normale
La proliferazione normale dipende da vari eventi: 1.Fattori di crescita: la disponibilità dei fattori di accrescimento specifici per ogni tessuto è alla base della crescita cellulare, l’insufficenza di questi fattori porta alla morte cellulare 2.Dipendenza dall’ancoraggio: la proliferazione viene regolata attraverso interazioni transmembrana di proteine dette integrine, che fanno parte degli elementi della matrice extracellulare (ECM). Specifiche integrine riconoscono specifiche molecole di ECM. 3.Inibizione da contatto: il contatto con il medesimo tipo di cellule inibisce il movimento e la proliferazione cellulare. Il contatto con cellule di diverso tipo favorisce la motilità e la migrazione spontanea. 4. Riduzione della capacità di proliferazione: le cellule somatiche dei vertebrati si dividono un numero limitato di volte (50-70) prima di entrare in uno stato di senescenza e mantenere una attività metabolica, senza alcun’altra possibilità di divisione. Questo fenomeno è chiamato “Limite di Hayflick”

4 Ancoraggio sostanza fondamentale con il citoscheletro cellulare
S.Beninati

5 Il blocco della crescita cellulare, denominato senescenza , è stato ipotizzato da Hayflick* come meccanismo soppressivo della crescita tumorale e in grado di limitare quindi la capacità replicativa di una cellula tumorale incipiente . Inizialmente accolta con scetticismo, l'esistenza di senescenza e la sua importanza come meccanismo tumore soppressiva è ormai accettata . *Hayflick, L. (1965) The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell Res. 37: Recentemente** è stato riportato, che mentre le cellule senescenti non possono produrre una neoplasia, come citato da Hayflick*, esse possiedono la capacità di promuovere la crescita delle cellule preneoplastiche nei dintorni e in questo modo possono contribuire all’aumentata incidenza tumorale legata all'età. **Pazzolli E. & Stewart SA. (2008) Senescence: the good the bad and the dysfunctional. Curr. Opin. Genet. Dev.18(1):42-47.

6 Proliferazione anormale
Un programma di segnali e di sistemi di regolazione controllano la proliferazione cellulare. Questo equilibrio può essere distrutto da una varietà di fattori, come alleli mutanti ereditati dagli ascendenti, mutazioni somatiche insorte nell’organismo e cambiamenti epigenetici^ che alterano il livello di espressione dei geni. ^ I cambiamenti epigenetici del DNA sono modificazioni chimiche che sono coinvolte nella modificazione dell'espressione di geni. La metilazione del DNA permette il silenziamento di un gene mentre l'acetilazione degli istoni aumenta la trascrizione. Non è coinvolta quindi l'alterazione del genotipo,

7 fattori che possono portare alla trasformazione cellulare
L’immortalizzazione (capacità di moltiplicazione indefinita in vitro) e l’aneuploidia: le cellule diploidi arrivate allo stadio della senescenza, a volte danno origine a delle linee clonali che sopravvivono e si moltiplicano continuamente senza alcun limite. Generalmente la transizione passa attraverso cambiamenti telomerici^ risultanti in riarrangiamenti cromosomici e in aneuploidia^^. ^ Il telomero è la regione terminale del cromosoma che produce trascritti che si ipotizza siano implicati nella regolazione della telomerasi. La telomerasi è un enzima che aggiunge sequenze ripetitive di DNA non codificante, riallungando così i telomeri accorciati in modo da mantenere integri i cromosomi. In assenza dei telomeri la replicazione del DNA comporterebbe dopo ogni replicazione una significativa perdita di informazione genetica. Il progressivo accorciamento dei telomeri ad ogni ciclo replicativo appare associato all'invecchiamento cellulare. ^^ L'aneuploidia è una variazione nel numero dei cromosomi, rispetto a quello che normalmente caratterizza le cellule di un individuo della stessa specie. L'aneuploidia è quindi una anomalia cromosomica.

8 fattori che possono portare alla trasformazione cellulare
Parziale o completa mancanza di dipendenza dal Growth Factor: le cellule in trasformazione possono acquistare l’abilità di crescere nel siero più diluito o in presenza di una minore iniziale densità cellulare. Perdita dell’ancoraggio. Perdita della inibizione da conatto tipica delle cellule normali Perdita dell’inibizione del movimento: in conseguenza del deficit dei segnali per l’adesione fra le cellule. Svincolo dal meccanismo dell’apoptosi. La morte cellulare programmata necessaria per il ricambio cellulare non influenza le cellule trasformate Aumento dell’angiogenesi. Lo sviluppo di una circolazione accessoria che porta nutrimento a gruppi cellulari trasformati favorendone lo sviluppo.

9 Gene normale Gene mutato difettoso

10 IL TUMORE In patologia, un tumore o neoplasia è una massa abnormale di tessuto che cresce in eccesso e in modo scoordinato rispetto ai tessuti normali, e persiste in questo stato dopo la cessazione degli stimoli che hanno indotto il processo

11 La crescita incontrollata e scoordinata, a scapito dell‘omeostasi tissutale, di un gruppo di cellule è determinata da alterazioni del loro patrimonio genetico, ed è alla base di una vasta classe di malattie

12 Queste malattie sono classificate per diverse caratteristiche, ma principalmente in tre modi:
1. secondo il tipo istologico originario delle cellule proliferanti, principalmente in tumori epiteliali, mesenchimali, delle cellule dl sangue o del tessuto nervoso 2. secondo l'aggressività e il decorso clinico previsto, in tumori benigni (non cancerosi) e tumori maligni (cancerosi, o cancro); 3. secondo la stadiazione tumorale, o Classificazione TNM , per quanto riguarda i tumori maligni.

13 Affinché una cellula diventi tumorale, deve accumulare una serie di danni al suo sistema di controllo della riproduzione. Infatti il cancro è una malattia genetica delle cellule somatiche. Tutte le cellule cancerose e precancerose presentano alterazioni, spesso molto estese, del loro assetto cromosomico (cariotipo): il numero di cromosomi presenti nel loro nucleo può essere alterato e i cromosomi stessi sono danneggiati, multipli o mancanti (aneploidia).

14 Popolazione Cellulare Clonale
L'alterazione cromosomica delle cellule tumorali è talmente estesa da fornire la prova che in ogni caso di tumore tutte le cellule cancerose discendano da una unica cellula madre mutata (popolazione cellulare clonale) Tutte le cellule tumorali infatti condividono la stessa esatta forma di danno genetico, tanto complessa da rendere altamente improbabile l'eventualità di due cellule madri diverse che hanno subito per caso la stessa serie di mutazioni.

15 Alla base della patogenesi del tumore c'è la mutazione di determinati geni:
i proto-oncogeni, o oncogeni i geni oncosoppressori o antioncogeni i geni coinvolti nella riparazione del DNA.

16 Proto-oncogeni Un oncogene è un gene modificato, o una serie di nucleotidi che codificano una proteina, che indirizzano la cellula verso lo sviluppo di un fenotipo neoplastico. Solitamente gli oncogeni intervengono nello sviluppo tumorale e aumentano le possibilità che lo sviluppo (proliferazione e differenziamento) di una cellula si diriga in senso tumorale. Nuove ricerche indicano che piccoli RNA di nucleotidi, detti miRNA, possono controllare tali geni attraverso la downregolazione.

17 antioncogene Gene, detto anche gene oncosoppressore, che inibisce la proliferazione cellulare. Un gene oncosoppressore è un gene che codifica per prodotti che agiscono negativamente sulla progressione del ciclo cellulare proteggendo in tal modo la cellula dall'accumulo di mutazioni potenzialmente tumorali.

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19 Le mutazioni necessarie che una data cellula deve accumulare per dare origine a un cancro sono i seguenti, e sono comuni a tutti i tipi di cancro: acquisizione dell'autonomia moltiplicativa per sopravvenuta incapacità a sottostare ai meccanismi regolatori della proliferazione cellulare; 2. assenza di inibizione dipendente dalla densità (le cellule normali si moltiplicano fino a una definita densità cellulare, raggiunta la quale diventano quiescenti); 3. ridotta capacità di adesione con altre cellule o componenti tissutali;

20 4. assenza di matrice extracellulare (spesso digerita da proteasi dette metalloproteasi, ) che favorisce l'invasione di tessuti normali adiacenti; 5. Angiogenesi formazione di nuovi vasi sanguigni per fornire ossigeno e fattori nutritivi alle cellule tumorali; 6. riduzione o perdita della capacità differenziativa; 7. acquisizione della capacità di replicazione illimitata per effetto dell'espressione della telomerasi; 8. riduzione o perdita della possibilità di andare incontro a morte cellulare programmata (apoptosi). 9. perdita della cosiddetta inibizione da contatto.

21 TERAPIA In generale, la terapia del cancro - per quanto riguarda l'obiettivo di guarire l'organismo malato, di ridurre l'estensione della malattia ottenendo una regressione parziale, o di rallentarne la progressione - si basa sull'applicazione di una serie di tecniche diverse integrate fra di loro, con protocolli specifici per lo specifico tipo di cancro e per le caratteristiche del paziente, ferma restando la libertà di scelta del paziente fra i diversi approcci possibili e il suo consenso informato al protocollo proposto.

22 Poiché il cancro colpisce più frequentemente la popolazione anziana, in molti casi la regressione parziale o anche il semplice rallentamento della progressione equivale, in sostanza, alla guarigione completa, in quanto libera il malato dai sintomi di malattia per tutto il suo periodo di vita residua.

23 Le tecniche utilizzate sono:
la chirurgia la radioterapia la chemioterapia l'ormonoterapia la immunoterapia l'ipertermia E altre tecniche (termodistruzione con radiofrequenze; alcoolizzazione; crioterapia; embolizzazione e chemioembolizzazione), in genere appannaggio della radiologia interventistica

24 I tumori si suddividono in:
"benigni", sono costituiti da cellule che mantengono in parte le loro caratteristiche morfologiche e funzionali, pur esibendo autonomia moltiplicativa. Essi sono caratterizzati da un tipo di sviluppo detto espansivo, perché comprime i tessuti vicini senza distruggerli: i tumori benigni che originano dall'epitelio ghiandolare (adenomi) sono spesso avviluppati da una capsula di tessuto connettivo fibroso che li delimitano nettamente dai tessuti confinanti, coi quali assumono un rapporto di contiguità.

25 "maligni" o "cancro", sono invece costituiti da cellule che appaiono morfologicamente e funzionalmente diverse dalle corrispondenti normali. L'atipia morfologica, che è tanto maggiore quanto più indifferenziato è il tumore, si manifesta con mancanza di uniformità nella forma e nelle dimensioni delle cellule (polimorfismo) e degli organi cellulari, in particolare del nucleo, che è frequentemente ipercromico ed in fase mitotica. I tessuti vicini al tumore maligno vengono invariabilmente infiltrati e distrutti dalle cellule tumorali che si sostituiscono a quelle normali, fenomeno questo caratteristico della malignità e noto col termine "invasività neoplastica".

26 Aspetti citologici di malignità

27 Mitosi Atipiche Le figure mitotiche sono presenti in tutte le iperplasie, cioè tessuti in rapida crescita. Nelle lesioni maligne molte figure mitotiche sono atipiche o mitosi multiple

28 M M Mitosi ad anello

29 Gradi di differenziamento del tumore
Le cellule tumorali possono essere simili al tessuto dal quale hanno avuto origine: Il tumore si definisce ben differenziato

30 Tumore scarsamente differenziato
Se le cellule ricordano scarsamente il tessuto di origine la neoplasia si definisce come: Scarsamente differenziata

31 Tumore anaplastico La scomparsa totale della somiglianza con il tessuto d’origine conduce alla: Tumore anaplastico

32 Mucosa normale del colon
lume Cellule mucipare (Ricche di muco) Nuclei delle cellule epiteliali colonnari (piccoli) Mucosa normale del colon

33 Neoplasia begnina del colon
Cellule mucipare (Povere di muco) Nuclei delle cellule epiteliali (grandi e disordinati) Porzione basale

34 Neoplasia maligna del colon ben differenziata
Assenza di mucina Forma prismatica delle cellule conservata Nuclei irregolari per forma e disposizione Nuclei stratificati e ipercromici Nucleoli grandi e irregolari

35 Neoplasia maligna del colon scarsamente differenziata
Mitosi atipiche Variabilità della forma e delle dimensioni cellulari Pleomorfismo cellulare Nuclei disomogenei Pleomorfismo nucleare Scarsa somiglianza con il tessuto d’origine Nuclei colorati Ipercromatismo nucleare

36 "borderline", in alcuni casi, i tumori presentano un comportamento intermedio fra la malignità e la benignità (tumori "borderline") o risultano inclassificabili (tumori a comportamento biologico incerto). In questi casi, generalmente la frequenza delle metastasi è molto bassa e il decorso è lento

37 Il processo metastatico

38 Il processo metastatico
Quando il numero di cellule tumorali diviene visibile clinicamente, il tumore si definisce primario. Alcune cellule del tumore primario acquisiscono la capacità di penetrare e di infiltrare il sistema ematico e linfatico formando le metastasi

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40 Cellule tumorali in crescita
Le cellule si staccano dal tumore primario e invadono il sangue o la linfa Le cellule viaggiano attraverso il sangue o la linfa in altre parti del corpo Lasciano il letto ematico o linfatico e penetrano nei tessuti Si dividono formando tumori secondari o metastasi

41 La formazione delle metastasi è un processo complesso che deriva dalla proprietà, acquisita dalle cellule tumorali maligne, di degradare le proteine presenti in una barriera naturale presente sotto gli epiteli e sotto gli endoteli, la membrana basale.

42 emazie leucocita

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49 Metastasis ADHESION E.C. ADHESION B.M. PROTEOLYSIS INVASION

50 angiogenesi Uno degli eventi critici necessari per la crescita del tumore è la formazione di una rete capillare che possa nutrire le cellule tumorali. Questo processo è denominato Angiogenesi.

51 Vaso ematico dell’ospite
Rete capillare tumore Sistema arterioso Sistema venoso

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53 Farmaci citotossici Il controllo della crescita neoplastica si attua influenzando i processi di proliferazione cellulare, inducendo il differenziamento e la morte cellulare Un farmaco si definisce citotossico quando uccide la cellula neoplastica. La chemioterapia attuale utilizza farmaci citotossici

54 Farmaci differenzianti
Un’alternatica alla terapia citotossica è la terapia differenziativa. In questo caso il farmaco induce il differenziamento della cellula neoplastica e blocca la proliferazione.

55 Test di laboratorio Per dimostrare che un farmaco possieda attività differenziante è necessario effettuare una serie di prove di laboratorio. Misure della proliferazione cellulare 1. curve di crescita 2. conta cellulare 3. vitalità cellulare

56 Metaboliti Anche la ricerca di metaboliti legati alla crescita tumorale può essere utile Tali molecole vengono denominate “Markers” I markers studiati nel nostro laboratorio sono: Poliammine come fattori di crescita Enzima transglutaminasi come marker di differenziamento

57 Linee cellulari Si usano come modello di crescita cellulare neoplastica Noi useremo come campione il melanoma sia umano che murino Una delle caratteristiche del melanoma è che durante il differenziamento producono melanina Un pigmento nero

58 Modelli di studio Il melanoma

59 Il melanoma Il melanoma è un tumore cutaneo maligno che origina dai melanociti, cellule dello strato basale dell’epidermide responsabili della produzione di melanina. Sebbene la neoplasia insorga principalmente nella pelle, esistono altri siti possibili, tra cui la mucosa nasale ed ano-genitale, l’esofago, le meningi e l’occhio

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61 L’aspetto di ogni melanoma può variare ma, generalmente, mostrano tutti le caratteristiche definite ABCD Asimmetria: le due metà del neo non hanno stessa forma. Bordo: i bordi sono spesso sfumati e dal contorno irregolare. Colore: il colore è irregolare. Il neo presenta sfumature di colore nero e marrone, si osservano inoltre zone bianco, rosso, rosa o blu. Diametro: le dimensioni del neo cambiano.

62 Vengono adottati vari sistemi di classificazione per descrivere la profondità di invasione: il più utilizzato è il Metodo di Clark e quello di Breslow (BW) In particolare: - lesione di Clark di 1° livello, è un melanoma in situ confinato all’epidermide;BW 1 - lesione di Clark di 2° livello, caratterizzata da piccoli nidi e cellule singole nel derma papillare; BW 2 - lesione di Clark di 3° livello, il tumore invade il derma papillare; BW 3 - lesione di Clark di 4° livello, la lesione invade il derma in profondità (strato reticolare);BW 4 - lesione di Clark di 5° livello, il melanoma invade il tessuto sottocutaneo. BW 5

63 Linea cellulare di melanoma murino (B16-F10)
ESAME MORFOLOGICO Control AE Linea cellulare di melanoma murino (B16-F10) Cellule non trattate Cellule trattate con molecola differenziante (bassa conc) Morfologia stellata Cellule trattate con molecola differenziante (alta conc)

64 Presentazione di un lavoro di oncologia sperimentale

65 Trattamento di melanomi umani e murini con molecole differenzianti
Vari test di proliferazione e di invasione Ipotesi di metabolismo coinvolto nel controllo della crescita tumorale Poliammine e transglutaminasi

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68 motility adhesion BM digestion TGase activity - Theophylline
polyamines - Theophylline - other activators protein cross-linking motility TGase activity Polyamination of BM proteins adhesion BM digestion BM

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70 Controllo B16-F10 B16-F10 differenziate

71 Metastasis ADHESION E.C. ADHESION B.M. PROTEOLYSIS INVASION

72 Capillary lumen Tumor cell LN LN-R Target tissue Integrins BASEMENT MEMBRANE COMPONENTS Laminin Collagen IV Entactin Growth factors

73 Invasion (Boyden Chamber assay)
Control 72hr 48h medium Matrigel filter chemoattractant % invasion

74 I PARAMETRI CHE VENGONO CONTROLLATI PER AVERE LA CERTEZZA CHE UNA DATA MOLECOLA POSSA ESERCITARE POTERE ANTIPROLIFERATIVO E/O ANTIMETASTATICO SU DI UNA LINEA CELLULARE O SULL’ORGANO BERSAGLIO DI UN ANIMALE VITALITA’ CELLULARE PROLIFERAZIONE CELLULARE ANALISI MORFOLOGICA AL MO SEGNI DI DIFFERENZIAMENTO POTERE METASTATICO POTERE INVASIVO METALLOPROTEASI TRANSGLUTAMINASI POLIAMMINE MELANINA APOPTOSI ANGIOGENESI