LXIX CONVEGNO SISVET Perugia, Giugno 2015

Presentazione sul tema: "LXIX CONVEGNO SISVET Perugia, Giugno 2015"— Transcript della presentazione:

1 LXIX CONVEGNO SISVET Perugia, Giugno 2015 PCR REAL–TIME E LATERAL FLOW TEST, DUE DIFFERENTI APPROCCI PER RILEVARE E QUANTIFICARE RISPETTIVAMENTE DNA TRANSGENICO DI MAIS MON810 E PROTEINA CODIFICATA CRY1AB Cristina Rondini, Martina Torricelli, Elisa Pierboni, Gloria Raquel Tovo Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche, Perugia, Italia. INTRODUZIONE L’analisi degli OGM può essere condotta mediante metodi basati sulla rilevazione del DNA o della proteina codificata dalla sequenza transgenica. La PCR Real-time è considerata il gold standard per il controllo degli organismi geneticamente modificati (GMO), in quanto il DNA è una molecola più stabile rispetto alle proteine ed è presente in modo uniforme in tutte le cellule di un organismo. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di comparare risultati qualitativi e quantitativi, usando due differenti approcci per analizzare campioni di granella di mais: uno basato sul rilevamento della sequenza genica di mais GM MON810 in Fast PCR Real-time, l’altro basato sull’identificazione della proteina codificata, Cry1Ab (derivante da Bacillus thuringiensis) tramite immunosaggio competitivo rapido (Lateral Flow Test, LFT). MATERIALI E METODI Fast PCR Real-time I DNA di 18 campioni di granella di mais sono stati estratti con metodo CTAB e purificati con QIAamp DNA Mini kit (1) La qualità e la quantità dei DNA è stata valutata al fotometro e mediante test d’inibizione in Fast PCR Real-time per il gene endogeno del mais, ADH1 (Alcohol Dehydrogenase 1) (2). A questa fase hanno fatto seguito lo screening per il promotore 35S (CaMV), l’identificazione dell’evento GM specifico e la quantificazione di mais MON810 sempre in PCR Real-time in modalità Fast (2). Lateral Flow Test Gli stessi campioni di granella di mais sono stati sottoposti a test immunoenzimatico (LFT) per rilevare la presenza/assenza della banda corrispondente alla proteina Cry1Ab. Gli strip test sono stati poi analizzati per la valutazione quantitativa della proteina, mediante lo strumento Quickscan (3). RISULTATI Dall’analisi qualitativa in PCR Real-time e in LFT si ha una totale concordanza dei risultati, in quanto i campioni negativi e quelli positivi risultano tali da entrambe le metodiche. Dall’analisi quantitativa dei 10 campioni positivi è stata rilevata concordanza tra le due tecniche per i valori superiori al 5% di contenuto transgenico (Tabella 1). Nell’analisi quantitativa e’ stata osservata discordanza per i campioni 2, 3, 8 e 10. In qPCR questi sono risultati essere inferiori al limite di quantificazione (LOQ) del metodo, corrispondente a 20 HGE (haploid genome equivalents) con valori pari a 0.30%, 0.15%, 0.05%, 0.04% rispettivamente. Pertanto risultano non quantificabili per mais GM MON810 (Tabella 1). Per gli stessi campioni, l’analisi mediante Quickscan ha fornito valori di concentrazione proteica che va dall’ 1% al 2.9% di MON810 (Tabella 1; Figura 1). MON810 ID campione DNA (%) Cry1Ab (%) 1 > 5% (100%) > 5% 2 < LOQ 20 HGE (0,30%) 1% 3 < LOQ 20 HGE (0,15%) 1,70% 4 5 > 5% (10%) 6 7 8 < LOQ 20 HGE (0,05%) 9 non rilevato < LOD 10 < LOQ 20 HGE (0,04%) 2,90% 11 12 13 14 15 16 17 18 > 5% (5,4%) campione 1 campione 2 campione 3 campione 8 campione 10 Tabella 1. Risultati ottenuti dall’analisi dei campioni di granella di mais mediante Fast PCR Real-time (DNA %) e Quickscan (Cry1Ab %) Figura 1. Risultati del Lateral Flow Test (Quickscan) per alcuni campioni positivi DISCUSSIONE Le differenze osservate per i risultati quantitativi ottenuti mediante i due approcci, PCR Real-time e LFT, sono dovute al fatto che il DNA è presente in egual misura in tutto il genoma della pianta, mentre la proteina cambia livello di espressione sia nelle fasi di crescita che nei vari tessuti. In conclusione, per le materie prime è possibile adottare anche la metodica LFT al fine di identificare il contenuto proteico GM anche per un rapido screening, sempre da confermare quantitativamente mediante PCR Real-time, metodo riconosciuto dalla legislazione vigente (4; 5; 6). Bibliografia: 1. ISO 21571:2005/Amd.1:2013; 2. UNI EN ISO 21570:2013 (Annex A.1) Decreto 27 novembre Gazzetta Ufficiale n°281, ; 5. Regulation (EC) No 1829/2003; 6. Regulation (EC) No 1830/2003. Stampato a cura dell'Unità Operativa di Supporto Biblioteca, Informazione, Editoria (2013). Quest'opera è stata rilasciata sotto la licenza Creative Commons Attribuzione-Non commerciale-Non opere derivate 2.5 Italia. Per leggere una copia della licenza visita il sito web o spedisci una lettera a Creative Commons, 171 Second Street, Suite 300, San Francisco, California, 94105, USA.