Programma Applicazione della genetica microbica e biotecnologie (tecnica del DNA-ricombinante, vettori di clonaggio e mutagenesi) L’era genomica ed i genomi.

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1 Programma Applicazione della genetica microbica e biotecnologie (tecnica del DNA-ricombinante, vettori di clonaggio e mutagenesi) L’era genomica ed i genomi microbici: Genetica e genomica batterica indirizzata allo studio dei nuovi target molecolari (PCR e progettazione di primers, Real-Time PCR, DNA sequencing; analisi di sequenza, comparazione di sequenza nucleotidiche e aminoacidiche (BLAST, Clustalw, ExPASy) Diagnostica immunologica, anticorpi monoclonali, Sistemi diagnostici a DNA Probiotici e loro applicazioni, microbiomi Bersagli e saggi per scoprire nuovi agenti antibatterici: morte cellulare programmata quale bersaglio per antibiotici, sRNA, sistemi TA Testi consigliati: Biologia dei microrganismi, Gianni Deho, Enrica Galli Molecular Genetics of Bacteria- Jeremy Dale Editor John Wiley and Sons Molecular Genetics of Bacteria-Snyder&Chapman ASM Pre Microbial Biotechnology – Lee Yuan Kun Glick et al – Molecular Biotechnology 3th ed. ASM

2 Ruolo dei microrganismi in natura e loro utilizzazione da parte dell’uomo
Alcune proprietà dei batteri hanno facilitano gli esperimenti di genetica: i batteri sono aploidi tempo di generazione breve riproduzione asessuata (formazione di cloni) crescita su terreno solido (individuazione di ceppi mutati) coltura pura selezione : mutanti (condizioni selettive di crescite) mantenimento delle colture batteriche scambi genetici: trasformazione, coniugazione, trasduzione

3 Microbial diversity prokaryotic cells on Earth = 6 X 1030
Abundant in environments where eukaryotes are rare How many species? -Lack diagnostic morphological characteristics -Exchange genetic material in unique and unusual ways -Same species = 70% DNA-DNA hybridization -Under estimating prokaryotic diversity -Practical limitations in counting - 1% cultivable

4 L’Era Genomica Il 1995, data della pubblicazione del prima genoma procariotico (Haemophilus influenzae) segna l’inizio dell’era genomica. 4 Da: Binnewies et et al. (Funct. Integr. Genomics 6: , 2006) 4 4

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6 outline Bacterial genome size Core Horizontal Gene Transfer (HGT)
Mechanisms of HGT Detecting HGT Comparative genomics Universal Tree of Life Applications of microbial genomics: 6

7 La Genomica Genomica Funzionale. Studio delle funzioni dei geni, delle loro interazioni (pathways metabolici) e dei meccanismi che ne regolano l’espressione. Genomica Strutturale. Studio della struttura del genoma, identificazione di geni, di elementi regolatori ed altre entità informazionali. 7 7

8 La Genomica Comparata Stele di Rosetta (British Museum)
Gli studi di Genomica Strutturale e Funzionale traggono grande vantaggio dall’analisi comparativa dei genomi e dei loro prodotti di espressione. Il confronto di entità “omologhe” ci aiuta ad interpretare l’informazione genica. 8 8

9 L'era genomica 1995: Haemophilus influenzea - primo genoma batterico sequenziato completamente paia di basi 1996: Saccharomyces cerevisiae - primo genoma eucariotico sequenziato paia di basi 2000: Drosophila melanogaster paia di basi Homo sapiens - in corso paia di basi 9

10 TIGR ( The Institute for Genomic Research ( http://www.tigr.org)
Microbial Genomes   Organism Size (Mb) G+C   Status   Funding                                                                                                                                                                                                Bacteriovorax marinus 3.44 36.7% Finished Wellcome Trust Bacteroides fragilis NCTC9343 5.20 43.1% Beowulf Genomics Bacteroides fragilis 638R ~5.2 43% Finishing/ gap closure Bordetella avium 3.73 61.6% USDA Bordetella bronchiseptica 5.34 68.1% Parkhill et al. Nature Genetics (2003) Bordetella parapertussis 4.77 Bordetella pertussis 4.09 67.7% Burkholderia cenocepacia (formerly Burkholderia cepacia) 66.9% TIGR ( The Institute for Genomic Research (

11 La scelta dei microrganismi da sequenziare è proporzionale al loro interesse nel settore scientifico e sociale Biomedico: sequenziamento di microrganismi patogeni responsabili di gravi malattie o malattie particolarmente diffuse Biotecnologico: identificazione di nuovi enzimi da utilizzare in biotecnologia (es:gli enzimi di microrganismi sono più stabili a temperature elevate)

12 Analisi e gestione del genoma dei procarioti
La genomica: studio della struttura, dell’informazione contenuta in essa (espressione genica e genomica funzionale) e dell’evoluzione dei genomi. Obiettivo principale dell’analisi dei genomi è: conoscere e capire la biologia di ciascun organismo in termini di funzionalità ed evoluzione. Bioinformatica denominata anche “Biologia computazionale”: settore interdisciplinare che utilizza un approccio informatico per risolvere problematiche di tipo biologico. Gioca un ruolo determinante nelle applicazioni di genomica funzionale, genomica strutturale e proteomica. Ha un ruolo fondamentale anche nello sviluppo di nuovi farmaci (drug discovery). -Analisi del “complex interplay” di differenti geni contemporaneamente - necessità di tecnologie nuove Scienze “omiche”…genomica, trascrittomica, Proteomica, metabolomica, fenomica…………

13 La conoscenza di un genoma e la regolazione
dei singoli geni: ricerca di “genetic weakness” da utilizzare come potenziali target per la scoperta di nuovi antibiotici conoscenze e regolazione di geni coinvolti nelle vie metaboliche per la coltivazione di “ microrganismi esigenti” comparazione genica (comparativa genomics) tra microrganismi patogeni e non patogeni per l’individuazione di geni coinvolti nella patogenicità

14 Metagenomics is an emerging tecnology that enable the study of bacteria using genetic information from DNA that is extracted directly from natural environments

15 Tecnologie innovative per il sequenziamento
Criteri di qualità del sequenziamento: completezza: assenza di regioni non sequenziate Accuratezza: misura della coerenza interna della sequenza : % di errore struttura: assemblaggio delle sequenze ottenute (subcloni, conting) G. Dehò, E. Galli     Biologia dei Microrganismi     Copyright 2012 C.E.A. Casa Editrice Ambrosiana

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17 History of DNA sequencing……
Based on chain –termination method

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22 Chromosome walking

23 Selection of primers for Polymerase Chain Reaction
Un fattore fondamentale per la “qualità” delle PCR è la scelta del primers specificità valutare Tm (Melting temperature ) stabilità del primer (formazione di dimeri e loops) 23

24 Chromosome walking mediante PCR e sequenziamento diretto
- Inverse-PCR - Anchored-PCR

25 Chromosome walking by Inverse-PCR
primer primer

26 PCR inversa (IPCR) 1. Digestione del DNA Con enzimi di restrizione
EcoRI Bam HI primer 1 primer 2 1. Digestione del DNA Con enzimi di restrizione 2. Ligazione e circolarizzazione PCR con i primer orientati verso l’esterno Xho

27 Inverse PCR & DNA sequencing Rapid identification of transposon-inserted flanking sequence by inverse PCR method

28 unknown fragment /known fragment amplified specific fragment
Anchored-PCR Genomic DNA Restricted and ligated to the generic oligomer linker Vector/generic oligo unknown fragment /known fragment Vector/generic oligo Unknown fragment/ known fragment Vector/generic oligo amplification amplified specific fragment

29 Sequenziamento NGS: Next Generation Sequencing

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