Validazione del METODO DI Conferma per la determinazione simultanea DELLE aflatossine b1, b2, g1 e g2 in prodotti alimentari eD alimenti per uso zootecnico.

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1 Validazione del METODO DI Conferma per la determinazione simultanea DELLE aflatossine b1, b2, g1 e g2 in prodotti alimentari eD alimenti per uso zootecnico mediante hplc con derivatizzazione fotochimica on-line e rivelazione fluorimetrica UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI FOGGIA M. Muscarellaa, M. Iammarinoa, D. Nardielloa, S. Lo Magroa, C. Palermo b, D. Centonzeb a Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata, Foggia; b Dipartimento di Scienze Agro-Ambientali, Chimica e Difesa Vegetale, Università degli Studi di Foggia INTRODUZIONE. Le aflatossine (AF) B1, B2, G1, G2 sono metaboliti prodotti da Aspergillus flavus e da Aspergillus parasiticus. A causa della loro attività cancerogena, genotossica ed immunosoppressiva verso molte specie animali, uomo compreso, esse sono state inserite nel gruppo I dello IARC. Le aflatossine (AF) sono responsabili della contaminazione di vari alimenti di origine vegetale fra i quali cereali, semi oleaginosi, frutta a guscio, frutta secca, alimenti per l’infanzia e mangimi. Le AF appartengono alla categoria B dell’allegato 1 della Direttiva 23/1996/CE e, come prescritto dal Regolamento (CE) N. 1881/2006 [1], per tali sostanze è stato fissato un valore di livello massimo consentito (LM) che nei prodotti alimentari destinati al consumo umano diretto è pari a 2.0 µg/kg per l’aflatossina B1 (20.0 µg/kg per le materie prime per mangimi) e 4.0 µg/kg per le AF totali. Il metodo più utilizzato per l’analisi di conferma delle aflatossine è la cromatografia liquida ad elevate prestazioni con rivelazione a fluorescenza. Il problema principale è che non tutte le aflatossine sono naturalmente fluorescenti; infatti le aflatossine B1 e G1 possono essere determinate, a basse concentrazioni, solo previa derivatizzazione. Scopo del presente lavoro è la validazione di un metodo HPLC con derivatizzazione fotochimica post-colonna, che consente, mediante irradiazione UV degli analiti in fase mobile acquosa, di trasformarli nei corrispondenti derivati idrossilati fluorescenti, esaltandone la risposta. Lo schema di validazione descritto consente di integrare il Reg. 401/2006/CE [2] con i protocolli europei in materia di validazione, riportati nella Decisione 657/2002/CE [3]. MATERIALI E METODI. 15 g di campione macinato sono trattati con 30 ml di una soluzione metanolo-acqua 80:20 per l’estrazione delle aflatossine. Dopo agitazione con vortex e filtrazione, 2 ml del filtrato, aggiunti a 8 ml di PBS, vengono purificati mediante colonnine ad immunoaffinità (AflaCLEAN™, 3 ml). L’estratto purificato è stato analizzato mediante HPLC con derivatizzatore fotochimico on-line e rivelazione a fluorescenza (Fig. 1): Cromatografo Liquido Agilent (mod. 1200) Colonna cromatografica ZORBAX Eclipse XDB C18 (L=15 cm, d.i.=4.6 mm, d.p.=5µm); T colonna = 40°C Fase Mobile: acqua:acetonitrile:metanolo (55:15:30); Flusso = 1 ml/min Detector spettrofluorimetrico (λecc= 365 nm, λem=435 nm) Derivatizzatore fotochimico UVE™ LCTech (LabService Analytica), λderivatizzazione= 254 nm. L’HPLC con rivelazione a fluorescenza può essere adoperata come metodo quantitativo di conferma per la determinazione delle aflatossine, purché i requisiti del metodo soddisfino quanto indicato nel Regolamento N. 401/2006/CE [2]. Tale normativa individua i criteri di precisione e di accuratezza da soddisfare e definisce, con il Regolamento 882/2004/CE [4], i parametri di prestazioni del metodo da valutare. I requisiti del metodo analitico sono stati verificati tramite una procedura di validazione condotta integrando quanto specificato nel Reg. 401/2006/CE con i protocolli riportati nella Dec. 657/2002/CE e seguendo le indicazioni descritte nella Linea Guida degli IIZZSS per la validazione intra-laboratorio dei metodi di conferma per la determinazione di micotossine [5]. Aflatoxin B1 Figura 1 – Rappresentazione schematica dell’apparato strumentale HPLC/FLD con derivatizzazione fotochimica post-colonna Figura 2 – Campione di semola di grano fortificato con AFB1 e AFG1 a 3.0 µg/kg e con AFB2 e AFG2 a 0.75 µg/kg A) con e B) senza derivatizzazione fotochimica . RISULTATI. Il metodo di analisi proposto è stato validato sia per le materie prime per mangimi (Tab.1) che per i prodotti alimentari (Tab. 2). I criteri di rendimento per i prodotti alimentari, valutati su 3 sedute analitiche per i primi e su 2 sedute per i secondi, a 0.5, 1 ed 1.5 il limite massimo consentito, sono risultati rispondenti a quanto definito nel Reg. 401/2006/CE. La selettività del metodo, valutata analizzando 10 campioni per specie (grano, mandorle, pistacchi, mais e avena), ha consentito, in combinazione con le prove di robustezza, l’applicazione del metodo di analisi alle matrici sopra indicate. Infine, sia i limiti di decisione (LOD e LOQ) (Tab.3) che i valori d’incertezza estesa relativa % per l’Aflatossina B1 (10.1%) e per le Aflatossine totali (13.0%), garantiscono un livello di precisione adeguato per l’analisi di conferma. In Figura 2 è mostrato il confronto tra il profilo cromatografico di un campione di semola di grano additivato con e senza derivatizzazione fotochimica. Tempo/min Segnale / L.U. Aflatoxin B2 Tabella 2 – Riproducibilità intra-laboratorio per la determinazione delle aflatossine in campioni di semola di grano Tabella 1 – Ripetibilità e riproducibilità intra-laboratorio per la determinazione delle aflatossine in campioni di grano duro Tabella 3 – Parametri di calibrazione. Aflatoxin G1 a RSD: deviazione standard relativa in condizioni di ripetibilità (RSDr) e riproducibilità intra-laboratorio (RSDR). a RSDR: deviazione standard relativa in condizioni di riproducibilità intra-laboratorio a y è il segnale espresso in unità di luminescenza (LU); x è il valore della concentrazione in µg/L. b Coefficiente di correlazione. c Valori espressi in µg/L CONCLUSIONI. Nel presente lavoro è stato validato un metodo per la determinazione simultanea delle aflatossine, basato sulla cromatografia liquida ad alte prestazioni con rivelazione fluorimetrica, previa derivatizzazione fotochimica on-line [6]. La procedura di validazione, effettuata in accordo con quanto definito nel Regolamento 882/2004/CE, ha dimostrato la rispondenza dei requisiti del metodo ai criteri previsti dal Regolamento 401/2006/CE, confermandone l’affidabilità nel controllo ufficiale delle aflatossine B e G nei prodotti alimentari e nelle materie prime per mangimi. La procedura di validazione descritta risulta particolarmente utile nel campo delle analisi multi-residuali delle micotossine in varie matrici, per le quali sono stati stabiliti differenti limiti di legge RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI. Regolamento della Commissione Europea N.1881/2006, 19 Dicembre 2006, G.U.C.E., L364, 5-24. Regolamento della Commissione Europea N. 401/2006, 23 Febbraio 2006, G.U.C.E., L 70, Decisione della Commissione Europea N. 657/2002, 12 agosto 2002, G.U.C.E., L221, 8-36. Regolamento della Commissione Europea N. 882/2004, 29 Aprile 2004, G.U.C.E., L 165, Linea guida per la validazione intra-laboratorio di metodi di prova di conferma per la determinazione delle sostanze di categoria B in accordo con la Decisione 657/2002/CE (Sezione 4 – micotossine) (gruppo di lavoro II.ZZ.SS). M. Muscarella, M. Iammarino, D. Nardiello, S. Lo Magro, C. Palermo, D. Centonze, D. Palermo, Food. Addit. Contam. 26 (2009) 1402. Aflatoxin G2 Lavoro eseguito con i fondi di ricerca corrente del Ministero della Salute (Progetto RC–IZS PB 005/06). Si ringraziano G. Battafarano e P. D’Antini (Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata – FOGGIA) per la collaborazione tecnica. III CONGRESSO NAZIONALE: LE MICOTOSSINE NELLA FILIERA AGRO-ALIMENTARE E ZOOTECNICA, Roma Settembre 2009