Dipartimento di Medicina Veterinaria

Presentazione sul tema: "Dipartimento di Medicina Veterinaria"— Transcript della presentazione:

1 Dipartimento di Medicina Veterinaria
Diagnostica Molecolare nel latte massale; cosa si può cercare e trovare Prof. Marco Pittau Dipartimento di Medicina Veterinaria Sassari

2 Titolo del Progetto di Ricerca
Selezione pubblica per il reclutamento di ricercatori a tempo determinato finanziati dalla Regione Sardegna, ai sensi della L.R. 3/2008 (RIENTRO CERVELLI) Titolo del Progetto di Ricerca Implementazione di metodiche diagnostiche biomolecolari per la valutazione dello stato sanitario degli allevamenti ovi-caprini e bovini in relazione a patologie ad alto impatto socio-economico Area Scientifico - Disciplinare Area della ricerca sanitaria sull’innovazione nell’assistenza e sul trasferimento dei risultati della ricerca scientifica nella pratica clinica Coordinatore Scientifico: dott.ssa Tania Carta

3 Obiettivi generali, specifici e operativi
Allestimento, standardizzazione e validazione di metodiche biomolecolari altamente sensibili che permettano, attraverso un singolo campione di latte prelevato dal pool dell’intero allevamento (latte massale), l’identificazione degli agenti eziologici di alcune patologie diffuse in Sardegna e difficilmente rilevabili attraverso le classiche analisi batteriologiche; 2. Trasferimento delle conoscenze acquisite presso i laboratori A.R.A.S. attraverso la realizzazione di protocolli dettagliati delle metodiche di laboratorio e di tutte le informazioni necessarie per rendere le procedure diagnostiche applicabili su larga scala; 3. Organizzazione e analisi epidemiologica dei dati raccolti in riferimento ai differenti parametri (agenti eziologici, tipologia e caratteristiche degli allevamenti, dimensioni, collocazione geografica, ecc.); 4. Realizzazione di protocolli operativi atti a ridurre, negli allevamenti, la prevalenza delle infezioni determinate dai microrganismi oggetto dello studio.

4 Sorveglianza passiva Sorveglianza attiva Sospetto di malattia
possibili scenari Screening o monitoraggio in autocontrollo Veterinario IZS Definizione del problema Diagnosi Piani di controllo/eradicazione volontari magari incentivati

5 Sierologia (anticorpi)
Acidi nucleici (DNA ed RNA)

6 Estrazione automatizzata di DNA ed RNA mediante biglie magnetiche

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9 Materiali e metodi Allestimento di metodiche diagnostiche biomolecolari ad alta specificità e sensibilità (Real time-PCR) Real time-PCR Campioni di RNA estratti Campioni di DNA estratti primers utilizzati in PCR tradizionale oppure SRLV Negli esperimenti di Real time-PCR verranno utilizzati controlli interni per la valutazione della qualità delle estrazioni e l’individuazione di falsi negativi (beta actina). Gli esperimenti di Real time-PCR saranno basati sull’adattamento di primers utilizzati in PCR tradizionale, selezionati dalla letteratura, o da primers progettati ad hoc, e accoppiati a sonde Taqman. L’evoluzione della tecnica di PCR proposta dal saggio TaqMan permette una drastica riduzione sia dei tempi di esecuzione che del materiale consumato, utilizzando un solo strumento ed eliminando completamente l’impiego di reagenti radioattivi o tossici. Comparato alle PCR tradizionali, il test non solo mantiene spiccate caratteristiche di sensibilità, ma garantisce anche decisivi miglioramenti in termini di specificità, di precisione e d’intervallo di quantificazione del campione incognito. JSRV MAG MAP primers progettati ad hoc, e accoppiati a sonde Taqman < tempi di esecuzione e materiale consumato > SENSIBILITA’ E SPECIFICITA’ Controlli interni per la valutazione della qualità delle estrazioni e l’individuazione di falsi negativi (beta actina)

10 Obiettivi generali, specifici e operativi
Realizzazione, standardizzazione e validazione di nuove metodiche biomolecolari, per l’identificazione di alcuni microrganismi presenti nel latte e non rilevati attraverso le indagini batteriologiche di routine Mycobacterium avium paratuberculosis Mycoplasma agalactiae Small Ruminant Lentivirus (SRLV) Jaagsiekte Sheep Retrovirus (JSRV) Ricerca microrganismi Conteggio cellule Infezione si/no Poche specie batteriche e nessun virus

11 Quantità dei microrganismi presenti nel campione
Sensibilità dell’analisi batteriologica Quantità dei microrganismi presenti nel campione La percentuale dei capi infetti e la frequenza replicativa dei patogeni condizionano l’attendibilità della prova Micobatteri e micoplasmi sarebbero difficilmente isolabili dal pool di latte dell’intera azienda La ricerca di questi batteri è di primaria importanza: sia per consentire interventi profilattici atti a contenere le patologie negli animali, sia per identificare quegli allevamenti dove la presenza di agenti zoonotici possa rappresentare un serio pericolo per la salute umana sia per certificare prodotti derivati per la loro libera circolazione sui mercati internazionali La sensibilità dell’analisi batteriologica è, infatti, strettamente correlata alla quantità dei microrganismi presenti nel campione, strettamente dipendente dalle loro caratteristiche moltiplicative. Ne deriva che, nel latte massale, fattori quali la percentuale dei capi infetti e la frequenza replicativa dei patogeni condizionino l’attendibilità della prova. Per queste ragioni microrganismi quali micobatteri e micoplasmi sarebbero difficilmente isolabili dal pool di latte dell’intera azienda. La ricerca di questi batteri è comunque di primaria importanza sia per consentire interventi profilattici atti a contenere le patologie negli animali, sia e soprattutto per identificare quegli allevamenti dove la presenza di agenti zoonotici possa rappresentare un serio pericolo per la salute umana.

12 Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP)
Obiettivi La paratuberculosi (PTBC) o malattia di Johne, è una malattia infettiva cronica causata da Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) Lluis Luján, Univ. Saragozza Lluis Luján, Univ. Saragozza La malattia è caratterizzata da una enterite cronica i cui sintomi sono:diarrea, perdita di peso e dimagramento progressivo Lista B dell’OIE (Organizzazione Mondiale della sanità animale) Il primo è l’agente eziologico della paratubercolosi dei ruminanti, malattia infettiva cronica caratterizzata da un lungo periodo d’incubazione durante il quale si osserva la trasmissione dei micobatteri paratubercolari attraverso il latte. La diagnosi in questa fase, nella quale non sono presenti né sintomi clinici né alterazioni macroscopiche del latte, assume un’importanza fondamentale nel controllo e nella profilassi di questa patologia, ma ha una valenza ancora maggiore in considerazione del fatto che il microrganismo sembra essere coinvolto nella eziologia di alcune gravi patologie dell’uomo quali il morbo di Crohn e, a seguito di recenti ricerche, il diabete mellito tipo 1 (Dow et al., 2006; Sechi et al., 2007a, b, 2008) e la sarcoidosi (el Zaatari et al., 1996). Primi sintomi compaiono solitamente in animali di ~2-5 anni di età Diminuzione della produzione lattea, ipofertilità, anemia, febbre intermittente ed edema intermandibolare Negli stadi più avanzati della malattia è costante la comparsa di diarrea, talvolta profusa, cronica o intermittente, con periodi di remissione anche di alcune settimane o mesi

13 Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP)
Obiettivi Revisión bibliográfíca Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) Caratterizzata da un lungo periodo d’incubazione durante il quale si osserva la trasmissione dei micobatteri paratubercolari attraverso il latte Istopatologicamente si tratta di una enterite granulomatosa e linfoadenite, particolarmente a livello del digiuno, ileo e linfonodi mesenterici associati¹ Meneguz Meneguz Lluis Luján, Univ. Saragozza Lluis Luján, Univ. Saragozza Lluis Luján, Univ. Saragozza Lluis Luján, Univ. Saragozza Negli USA i produttori hanno perdite annuali di circa 1,5 bilioni di euro Fig. 1) Aspetto macroscopico dei tratti distali del digiuno e dell’ileo caratterizzati da evidente linfangectasia. Aquí podemos ver unos detalles de las catenas de los mesentericos y linfoadenitis granulomatosa en un ciervo de los Alpes italianos Fig. 3) Ileo. Classico aspetto “a scala di corda” della mucosa evidenziabile negli stadi più avanzati dell’infezione. Los estadios iniciales y subclinicos de la enfermedad se caracterizan por una alta respuesta inmune celular, mientras en estadios clinicos avanzados, predomina la respuesta humoral. Aun asi, en casos de paratuberculosis inducida experimentalmente, se ha observado la produccion de anticuerpos anti-MAP que incluso preced la respuesta inicial tipica (Waters, 2003) Il microrganismo sembra essere coinvolto nella eziologia di alcune gravi patologie dell’uomo quali il morbo di Crohn e, a seguito di recenti ricerche, il diabete mellito tipo 1², la sarcoidosi³ e la sclerosi multipla4 1. Balseiro et al Dow et al., 2006; Sechi et al., 2007a, b, el Zaatari et al., 1996, ; Sechi et al., 2011

14 Mycoplasma agalactiae
Obiettivi Agente eziologico dell’agalassia contagiosa, malattia infettiva altamente contagiosa caratterizzata da lesioni mammarie, articolari e oculari Rappresenta uno dei maggiori problemi per l'economia rurale di molti paesi che si affacciano sul bacino mediterraneo dove la pastorizia rappresenta la principale risorsa economica nel settore zootecnico Considerata seconda soltanto alla Brucellosi per le sue gravi ripercussioni sanitarie ed economiche Particolarmente colpite sono le femmine dopo il parto ma anche nei giovani animali può manifestarsi in maniera cronica. La principale fonte di infezione è rappresentata dal latte infetto proveniente da pecore malate o portatrici. L’ Agalassia Contagiosa (AC) è una malattia cosmopolita ad andamento epidemico che colpisce i piccoli ruminanti. L’agente eziologico è il Mycoplasma agalactiae. La malattia provoca mastiti, con brusche riduzioni della produzione di latte, artriti e cheratocongiuntiviti, a seconda del momento in cui avviene l’infezione si possono evidenziare anche episodi di polmonite, infezioni urogenitali e aborto. I danni economici provocati dalla malattia all’interno degli allevamenti sono molto rilevanti soprattutto in quelle aziende nelle quali il patogeno fa la sua comparsa per la prima volta. La patologia per la sua gravità è compresa nella lista delle malattie soggette a denuncia nel regolamento di polizia veterinaria. A causa dei notevoli danni economici provocati dall’Agalassia Contagiosa in numerosi paesi sono in atto piani di eradicazione e di controllo. Purtroppo a tutt’oggi non esistono ancora degli strumenti di tipo profilattico e/o terapeutico in grado di riuscire ad eliminare con certezza la patologia. La profilassi vaccinale attualmente consiste nell’utilizzo di vaccini spenti che sono efficaci per ridurre la sintomatologia clinica, ma presentano tutti gli svantaggi dei vaccini spenti ed inoltre non prevengono l’infezione. E’ necessario quindi migliore la profilassi vaccinale contro M.agalactiae facendo ricorso anche ai vaccini di nuova generazione. A volte è probabile che la carica dei microganismi sia talmente bassa o addirittura è possibile che i micoplasmi non siano più vitali in modo da non poter essere messi in evidenza dall'isolamento anche facendo tre passaggi ciechi ogni 4giorni (12 giorni totali).  La PCR essendo un metodo molto sensibile (teoricamente è sufficiente una molecola di DNA target) riesce a svelare pochi microrganismi; anche nel caso in cui tali microrganismi non siano più vitali, tale metodica è in grado di rilevare il DNA del Mycoplasma agalactiae.  Data la rapidità e la specificità della PCR tale tecnica può essere utilizzata di routine per la diagnosi di agalassia contagiosa.  Sono ricettivi ovini e caprini 1. Carter & Chengappa, 1991

15 Mycoplasma agalactiae
Obiettivi Prove biochimiche 3-4 gg 4-8 gg Data la rapidità della diffusione dell'infezione in un gregge (se in lattazione) è importante applicare delle procedure diagnostiche sensibili e rapide La trasmissione avviene principalmente x via intracanicolare mammaria (mungitura) L'agente patogeno è presente nel latte e in secrezioni di varia natura (liquido lacrimale) Ancora non esistono degli strumenti di tipo profilattico e/o terapeutico in grado di riuscire ad eliminare con certezza la patologia A causa dei notevoli danni economici in numerosi Paesi sono in atto piani di eradicazione e di controllo.  Per quanto riguardale altre due diagnosi discordanti, cioè positive all'isolamento e negative in PCR, c'è da dire che l'isolamento non discrimina il tipo di micoplasma, infatti con l'isolamento è possibile solo dire positivo per micoplasma spp. Per tipizzare i micoplasmi bisogna fare delle prove biochimiche che richiedono altri 3 o 4 giorni dopo il periodo di isolamento.  Tale malattia appartenente alla lista B dell'OIE può senz'altro essere considerata seconda soltanto alla Brucellosi per le sue gravi ripercussioni sanitarie ed economiche. Nella specie ovina l'infezione è causata prevalentemente da un micoplasma altamente patogeno (M.agalactiae), meno frequentemente da altre specie legate maggiormente all’infezione nelle capre (M. m. subsp. mycoides LC, M. capricolum, M. putrefaciens). Il nome della malattia prende appunto origine/deriva dal sintomo clinico principale: una severa mastite sub-acuta o cronica che porta nella maggior parte dei casi ad una totale interruzione della lattazione.  A differenza delle altre mastiti idiopatiche degli ovi-caprini, legate generalmente a condizioni di "allevamento pastorale" e controllabili con adeguate misure di profilassi diretta e con la terapia antibiotica, l'Agalassia contagiosa è una vera e propria malattia infettiva che si diffonde facilmente tramite il contatto diretto tra animali e con la mungitura; pertanto una conduzione razionale dell'azienda spesso non è sufficiente a prevenire l'insorgenza ed il diffondersi del contagio. Il Mycoplasma agalactiae può inoltre localizzarsi nelle articolazioni o nella camera anteriore dell'occhio causando artrite ed anchilosi o una cheratite che può evolvere sino alla perdita funzionale dell'organo. La vaccinazione con il vaccino inattivato dà un buon grado di protezione ma richiede rivaccinazioni. L''agalassia contagiosa dei piccoli ruminanti rappresenta uno dei maggiori problemi per l''economia rurale di molti paesi che si affacciano sul bacino mediterraneo. Dove la pastorizia rappresenta la principale risorsa economica nel settore zootecnico. L''agalassia contagiosa è causata dal Mycoplasma agalactiae, ma i sintomi di mastite, artrosinovite e cheratocongiuntivite possono essere acusati anche da altri micoplasmi Tra cui: Mycoplasma mycoides subsp. mycoides LC (MmmSC),  Mycoplasma mycoides subsp. capri (M.m.capri), Mycoplasma capricolum e Mycoplasma putrefaciens. Nel presente lavoro viene preso in considerazione un gregge ovino di 500 capi circa affetti da mastite, artrosinovite e solo in pochi casi di cheratocongiuntivite; dal latte di alcuni animali affetti da mastite è stato possibile isolare Mycoplasma agalactiae. Il latte dei medesimi animali è stato inoltre utilizzato, previa estrazione del DNA con fenolo-cloroformio, per la rilevazione diretta dell''agente eziologico mediante PCR, allo scopo di valutare la diffusione dell''infezione all''interno del gregge. Gli animali in lattazione, dopo essere stati sottoposti a trattamento con antibiotici (tetracicline e tylosina) e vaccinazione mediante latto-vaccino fenolato, sono stati controllati allo scopo di valutare la persistenza dell''agente di infezione anche nei soggetti con remissione dei sintomi clinici. 

16 Lentivirus Small Ruminant Lentivirus (SRLV) Obiettivi Maedi-Visna (MV)
Artrite encefalite virale (CAE) L’infezione è caratterizzata da un lungo periodo d’incubazione, evoluzione lenta e progressiva, esito invariabilmente letale virus appartenente alla famiglia retroviridae, genere lentivirus agente eziologico della Maedi Visna negli ovini e dell’artrite encefalite caprina. Maedi Visna è una malattia infettiva degli ovini che può presentarsi in due forme cliniche: una polmonite interstiziale progressiva (Maedi) ed una forma di leucoencefalomielite (Visna). L’infezione è caratterizzata da un lungo periodo d’incubazione, evoluzione lenta e progressiva, esito invariabilmente letale. La trasmissione preclinica (da animali asintomatici) avviene per via orale, attraverso il colostro e il latte, o per via iatrogena, attraverso l'impiego di aghi, siringhe o altro materiale infetto. L'Artrite-Encefalite caprina (AEC) è una malattia infettiva ad eziologia virale che si presenta in due forme cliniche ben distinte: una forma nervosa, più rara, che si riscontra prevalentemente nei capretti, ed una forma articolare, che si osserva in individui adulti, sovente associata a mastite cronica nelle femmine e, meno frequentemente , a polmonite interstiziale. L'infezione è ampiamente diffusa nei nostri. Gli animali sierologicamente positivi si considerano permanentemente infetti a causa dell’integrazione del genoma virale nel DNA delle cellule bersaglio

17 > Effetti collaterali vaccino vivo per la Blue Tongue/Maedi-Visna
Obiettivi La trasmissione preclinica (da animali asintomatici) avviene per via orale, attraverso il colostro e il latte, o per via iatrogena, attraverso l'impiego di aghi, siringhe o altro materiale infetto Nelle fasi iniziali dell’infezione, il virus si trova nel sangue associato ai monociti, in uno stato di latenza Con la maturazione dei monociti in macrofagi a livello degli organi bersaglio, il virus è poi capace di riattivarsi Polmonite interstiziale progressiva (Maedi) Graduale scadimento condizioni generali Dispnea e tosse secca senza febbre e scolo nasale Polmonite interstiziale progressiva Aborto, mastite interstiziale e artriti Decorso 3-6 mesi ad esito mortale Leucoencefalomielite (Visna) Encefalite demielizzante Portamento anormale di testa, tremori e paralisi degli arti posteriori Impossibilità a mantenere la stazione quadrupedale Rapido decadimento dello stato generale Esito letale > Effetti collaterali vaccino vivo per la Blue Tongue/Maedi-Visna Maedi Visna 70% capi controllati 25% allevamenti testati Sassari prevalenza

18 L'Artrite-Encefalite caprina (AEC)
Obiettivi FORMA NERVOSA + rara FORMA ARTICOLARE mastite cronica Individui adulti Capretti Trasmissione: aerogena, venerea, orale, transplacentare, iatrogena Il secreto mammario (colostro e latte) è la via di trasmissione più frequente Il latte infetto costituisce la modalità di trasmissione più frequente negli adulti Le femmine adulte infatti contraggono il virus per via mammaria ascendente Riflusso di latte infetto dalla mungitrice alla mammella > 75% delle capre infette, contrae l’infezione nei primi giorni di vita, attraverso la via alimentare La pratica di alcuni allevatori di miscelare il colostro di più fattrici amplifica la diffusione del virus nell’allevamento 20,44% capi controllati 64,16% allevamenti testati Nuoro prevalenza

19 Jaagsiekte Sheep Retrovirus (JSRV)
Obiettivi Virus a RNA esogeno¹ della famiglia Retroviridae Retrovirus oncogeno, è l'agente eziologico dell'adenomatosi polmonare degli ovini (APO), un carcinoma bronchiolo-alveolare contagioso degli ovini, molto simile alla forma umana (BAC) spesso associato al SRLV Cellule bersaglio: pneumociti di II tipo Trasmissione attraverso le secrezioni bronchiali (molto abbandonanti nei soggetti con manifestazioni cliniche) Il genoma virale si ritrova in quantità modeste nel sangue e nel latte JSRV è un retrovirus oncogeno che causa un carcinoma bronchiolo alveolare negli ovini molto simile alla forma umana (BAC) spesso associato al SRLV. Jaagsiekte sheep retrovirus (JRSV) è l''agente eziologico dell''adenomatosi polmonare degli ovini (APO), un carcinoma bronchiolo-alveolare contagioso delle pecore. L'Adenocarcinoma Polmonare Ovino (OPAC) o Adenomatosi Polmonare, è un tumore contagioso dei piccoli ruminanti a lento sviluppo e basso indice di metastatizzazione, il cui agente eziologico è un retrovirus tipo-D denominato Jaagsiekte Sheep Retrovirus (JSRV). Nel il 10% circa dei casi, la patologia risulta associata a pneumopatie interstiziali croniche causate da Maedi Visna Virus (MVV), lentivirus tipo-B responsabile anche di lesioni encefaliche, mammarie e articolari (1). L'esistenza e la qualità di eventuali sinergie fra i due virus è stata più volte sospettata ma non ha ancora trovato convincenti conferme sperimentali. Alcuni virus vengono trasmessi orizzontalmente da un animale all'altro - virus esogeni - mentre altri, essendo trasmessi verticalmente attraverso la linea germinale, sono detti virus endogeni: Palmarini et al, 1999

20 Materiali e metodi Elaborazione di protocolli operativi da applicare nella pratica clinica degli allevamenti al fine di ridurre la prevalenza delle infezioni, con l’obiettivo finale tendente all’eradicazione Elaborazione dei risultati Elaborazione di protocolli specifici di profilassi e controllo delle patologie rilevate Valida raccolta di base di dati lndividuazione e interpretazione delle interazioni dei differenti determinanti epidemiologici Si procederà quindi all’elaborazione dei risultati; contemporaneamente si procederà all’elaborazione di protocolli specifici di profilassi e controllo delle patologie rilevate. Monitorare il “trend” di una malattia (valutare la diffusione di un agente patogeno) Nell’ambito del progetto proposto i nuovi strumenti diagnostici disponibili in campo immunologico e biomolecolare, che raggiungono elevati standards di affidabilità e specificità, potranno consentire la raccolta di validate basi di dati, in ordine alla presenza e distribuzione dei patogeni indicati, da analizzare in relazione ai vari parametri citati per favorire l’individuazione e l’interpretazione delle interazioni dei differenti determinanti epidemiologici, in tal modo contribuendo a stabilire il rischio relativo per ciascun fattore, inteso sia singolarmente che cumulativamente. Sarà possibile così incrementare l’efficacia dei programmi di controllo e il valore predittivo dei protocolli da implementare. La base di informazioni così elaborate, oltre a rappresentare un valore, per così dire, di “istantanea” della situazione esistente, rappresenterà il substrato di conoscenze di riferimento sul quale valutare l’efficacia delle misure elaborate. Monitorare l’andamento di queste malattie, allo scopo di istituire una rete di sorveglianza che permetta di incrementare l’efficacia dei programmi di controllo e il valore predittivo dei protocolli da implementare

21 Allevamenti ovi-caprini
Allevamenti campionati

22 Agalassia contagiosa Schmallenberg

23 Sierologia Border disease
Virus sequenziati da latte

24 Chi è il colpevole ? Chi è il padre ?
Mycoplasma (Agalassia contagiosa) Mycobatteri (Paratubercolosi) Lentivirus (Maedi-Visna) Retrovirus (Adenomatosi polmonare) Pestivirus (Border disease) Bunyavirus (Schmallenberg) BTV (Bluetongue) Anaplasmi Etc… Chi è il padre ?

25 Grazie!