Parte 5 Estrazione e quantificazione del DNA nella genetica forense

Presentazione sul tema: "Parte 5 Estrazione e quantificazione del DNA nella genetica forense"— Transcript della presentazione:

1 Parte 5 Estrazione e quantificazione del DNA nella genetica forense
(Iacovacci)

2 Estrazione & Quantificazione del DNA estratto
Magg inv sc Giuseppe IACOVACCI Direttore della Sezione 4^ della Banca Dati Nazionale del DNA

3 ESTRAZIONE DEL DNA DAL CAMPIONE

4 Walsh et al Biotecniques 1991; 10: 506
IL PROTOCOLLO CHELEX Walsh et al Biotecniques 1991; 10: 506 Prevede la bollitura della traccia in una sospensione acquosa al 5% della Resina Chelex 100 e l’utilizzo diretto del supernatante in PCR. Rapido (da 15’ a 90’), economico (meno di €/reazione) e con altissima resa (fino al 98%) Ha il difetto di produrre un estratto poco “pulito” e che si degrada in tempi brevi se conservato a +4° inoltre è diluito in un volume che supera i 300 ul Reperti ammessi.

5 PROTOCOLLO CLASSICA METODO SINGLE TUBE
Sambroock et al Molecular cloning 1988 adattato da McIndoe et al Biotecnicques 1995; 19: 30 Prevede diverse fasi condotte in una unica provetta vacutainer con resina, fino alla precipitazione etanolica o filtrazione su microcon. Il protocollo è stato scomposto in punti successivi che possono essere adattati ai diversi reperti. Laborioso, prevede l’uso di solventi organici, resa circa 40% Purifica discretamente adattabile ad un ampia tipologia di tracce Reperti ammessi. 1 Pretrattamento 2 Digestione 3 Estrazione organica STAIN EXTRACTION BUFFER Composizione.- 10 mM Tris-HCl pH 8.0 >>>>>>>1: 100 di una madre 1 M 100 mM NaCl > MW 58.44>>>>>5.8 g\l 10 mM EDTA >MW >>>>>3.7 g/l del sale sodico diidrato 2% SDS >>>>>>>>>>>>>>>>>>>20 g\l 39 mM DTT > MW 154.2>>>>>>>6.2 g\l Rif. Techinical manual GenePrintTM STR System (Silver Stain Detection) Revised 5/98

6 Estrazione Differenziale I

7 Estrazione Differenziale II

8 Campionamento delle impronte mediante tamponi Prionics® con acetone e eluente del kit Hexagon OBTI®

9 Utilizzo di resine di silice
Il metodo si basa sull’affinità che il DNA, trattato con sali caotropici (isotiocianato di guanidinio), ha verso la silice. EZ1 QIAcube

10 Importanza della quantificazione

11 Importanza della quantificazione

12 Importanza della quantificazione

13 Eccesso di DNA in amplificazione
Difetto di adenilazione Pull up Aumento del rumore di fondo Pull up

14 Difetto di DNA in amplificazione
In queste condizioni l’analisi risulta affetta da problemi stocastici in questo caso dobbiamo interpretare il dato con un approccio LCN o LT

15 Normalizzazione Effettuabile con un liquid handler in automatico sulla base della quantificazione a meno di misture

16 Quantificazione del DNA estratto
DOT-BLOT ELETTROFORESI GEL AGAROSIO LA SPETTROFOTOMETRIA “UV” LA FLUORIMETRIA

17

18 Plexor® HY Amplification Targets 4-color, triplex Plexor® qPCR assay
Autosomal – fluorescein 99bp multicopy target (RNU2) on chromosome 17 repeated motif ~6kb Locus is conserved in primates Y – Cal Orange 560 133bp multicopy target (TSPY/DYZ5) on short arm repeat motif ~20kb IPC – Cal Red 610 150bp, novel target Normalizzatore di fluorescenza Multicopy targets Increased sensitivity and reduced impact of primer site mutation Autosomal and Y have similar copy number

19 Quantifiler Trio® LOQ a 5 pg/ul; Solo 5 punti per la curva standard.
Possibilità di monitorare la degradazione. Protocollo già validato ed inserito nel Metodo Interno

20 Power Quant®

21 Power Quant® LOQ a 3 pg/ul; Solo 4 punti per la curva standard.
Possibilità di monitorare la degradazione