ONCOGENI ed ONCOSOPPRESSORI

Presentazione sul tema: "ONCOGENI ed ONCOSOPPRESSORI"— Transcript della presentazione:

1 ONCOGENI ed ONCOSOPPRESSORI
Nabissi 2017

2 I prodotti degli oncogeni possono essere classificati in sei gruppi:
Fattori di trascrizione Rimodellatori della cromatina Fattori di crescita Recettori dei fattori di crescita Trasduttri del segnale Regolatori dell’apoptosi Nabissi 2017

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4 FATTORI DI TRASCRIZIONE I fattori di trascrizione (TF) sono spesso membri di una famiglia multigenica che mostra dei domini strutturali comuni e molti di questi fattori per funzionare richiedono l’interazione con altre proteine. Il TF regolano positivamente o negativamente l’espressione di determinati geni, legandosi a specifiche sequenze di DNA (promoter, enhancer, silencer). Esempi di TF, codificati anche da retrovirus sono c-myc, fos e jun. Nabissi 2017

5 Il gene myc è conservato in tutte le specie animali e fu
c-myc Il gene myc è conservato in tutte le specie animali e fu inizialmente scoperto in diversi retrovirus responsabili nell’induzione di sarcomi, carcinomi e leucemie mieloidi. La proteina codificata da myc è un fattore trascrizionale (p64myc) presente nelle cellule in attiva proliferazione anche se myc svolge un ruolo importante anche nell’indurre l’apoptosi. Myc è classificato tra i gene della pronta risposta insieme a fos e jun, indotti da fattori di crescita mitogenici, con il ruolo di indurre la progressione dalla fase G0-G1 alla fase S del ciclo cellulare. Nabissi 2017

6 geni che codificano per le CDK2 e CDK4
Myc e ciclo cellulare: cicline D, E e A geni che codificano per le CDK2 e CDK4 gene dell’enzima ornitina-decarbossilasi (ODC), essenziale nel metabolismo degli acidi nucleici reprime i geni delle CDKI (inibitori delle CDK) attiva i geni che codificano per E2F reprime il gene dell’inibitore delle CDK (p27KIP1). Nabissi 2017

7 fos e jun Il fattore di trascrizione fos (p55) dimerizza con il fattore di trascrizione jun (p39) per formare il fattore di trascrizione AP-1, il quale aumenta l’espressione di diversi geni che controllano la divisione cellulare. L’attività di AP-1 è indotta da fattori di crescita, citochine, ormoni polipetidici, neurotrasmettitori, interazione cellula-matrice, infezioni virali e batteriche e da diversi stress fisici e chimici. Nabissi 2017

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9 RECETTORI PER I FATTORI DI CRESCITA
L’eccessiva stimolazione della proliferazione cellulare, nei tumori, dipende anche dall’amplificazione o dalle mutazioni dei geni codificanti per i recettori dei fattori di crescita, con conseguente aumento dell’espressione dei recettori o la sintesi di recettori strutturalmente e funzionalmente modificati, con conseguente alterazione del segnale e guadagno di funzione. Tali recettori possono essere suddivisi in base ai residui presenti nella regione citoplasmatica in: tirosin-chinasici e serin/treonin-chinasici Nell’ambito dei tumori, i recettori tirosinchinasici (RTK) sono quelli maggiormente mutati nei tumori e sono tra i geni codificati dagli oncogeni virali. Nabissi 2017

10 I RTK si possono suddividere in: tirosinchinasi citoplasmatiche
recettori con attività tirosinchinasica I RTK sono suddivisi in diverse famiglie che si caratterizzano principalmente per la porzione aminoacidica extracellulare in: porzione ricca di cisteine come EGFR, IR, IGFR domini simili a quelli delle Ig (Ig like motif), come PDGFR e FGFR domini con sequenze di fibronectina combinate a sequenze Ig-like, come efrinaAR, efrinaBR, angiotensina .1R domini che reagiscono con le caderine in presenza di Ca2+ Nabissi 2017

11 Attivazione dei recettori
RTK: Il sito catalitico, in posizione C-terminale ha attività proteinchinasica, ed è costituito da tre regioni: 1) legante ATP, 2) attività fosfotransferasica, 3) contenente una proteinchinasi attivata da fosforilazione dopo legame del ligando al recettore. Gli RTK sono presenti in stato inattivo come monomeri e dimerizzano dopo interazione con il ligando. La dimerizzazione induce un cambiamento conformazionale che attiva il sito catalitico con attività tirosinchinasica, che induce fosforilazione nei siti catalitici che in altri residui. Nabissi 2017

12 Il primo segnale dell’attivazione del recettore, mediata dal ligando, e’ la fosforilazione nel dominio citoplasmatico del recettore stesso, mediata dalla dimerizzazione del recettore. receptor-directed protein-tyrosine phosphatases (PTPs) Nabissi 2017

13 Il legame ligando-recettore recluta proteine adattatrici contenenti SH2 domain
L’autofosforilazione dei recettori genera siti di fosforilazione i quali diventano siti recettivi per proteine SH2 che includono fosfolipasi C o GRB (growth factor receptor bound). I domini SH3 agiscono poi come domini di legame per domini ricchi in prolina presenti in molecole effettrici che agiscono come percorsi molecolari a valle. Nabissi 2017

14 Trasduzione del segnale
La posizione specifica delle tirosine presenti nei RTK è quella che rende che condiziona le interazioni con specifiche proteine citoplasmatiche da fosforilare. In particolare i domini SH2 presenti su specifiche proteine (proteine con attività enzimatica) vengono fosforilate dai TRK o mediante proteine adattatrici che facilitano il contatto con le proteine che sono substrato delle proteinchinasi. I residui carichi positivamente, presenti nelle regioni SH2 reagiscono con i gruppi fosfato (carichi negativamente) presenti sulle TK e permettono la formazione di un complesso che attiva la proteina contenente il dominio SH2. Altri domini proteici che interagiscono con le tirosine fosforilate sono i SH3 e PTB (phosphotyrosin binding). Nabissi 2017

15 FATTORI DI CRESCITA I fattori di crescita (GF) sono proteine di piccole dimensioni che stimolano la proliferazione, il differenziamento, la sopravvivenza e la motilità cellulare. La maggior parte dei GF hanno effetto positivo su questi fenomeni, anche se alcuni come il TGF-b (trasforming growth factor beta) agiscono come segnale inibitorio. Nell’ambito delle patologie tumorali molti geni che codifica per GF, si comportano da oncogeni, in quanto subiscono mutazioni tali da indurre la cellula ad una sovra-produzione del GF con conseguente attivazione di uno stimolo proliferativo autocrino o paracrino. Nabissi 2017

16 WNT SIGNALING Attivazione della trascrizione di geni bersaglio che inducono proliferazione cellulare e dissociazione delle E-caderine con conseguente perdita dei legami cellula/cellula e stimolo della mobilità cellulare. Nabissi 2017

17 Insulin Growth Factor (IGF)
Fra i vari fattori di crescita che giocano un ruolo determinante nei vari processi che inducono proliferazione cellulare, sopravvivenza cellulare e resistenza ai chemioterapici e radioterapia c’è il sistema IGF (insulin growth factor). Il sistema IGF consiste di due ligandi, IGF-I e IGF-II, tre recettori di membrana (IGF-IR, IGF-IIR) e recettore dell’insulina (IR) e sei proteine di legame ad alta affinità (IGFBP 1-6). I recettori IGF-IR una volta tradotti vengono glicosilati, dimerizzano e processati in due subunità a e b che attraverso ponti disolfuro vanno a formare il tetramero funzionante (b-a-a-b) che viene trasportato in membrana. Attraverso la subunità a che è extracellulare si ha il legame del IGF, con conseguente trasduzione del segnale a livello intracellulare che consiste nella fosforilazione di residui di tirosina in domini di tirosin chinasi. Nabissi 2017

18 La cascata di attivazione comporta, principalmente, tre tipi si segnali:
attivazione del pathways del fosfatidilinositolo 3- chinasi (PI-3K), Akt, mTOR che attiva la sintesi proteica e i meccanismi antiapoptotici mediante inattivazione (fosforilazione) di Bad attivazione del pathway di Ras/Raf1/MEK/ERK che induce proliferazione cellulare attivazione di altri meccanismi cellulari che inducono l’espressione di fattori di crescita, citochine e integrine Nabissi 2017

19 Inoltre il IGF-IR svolge un ruolo nel facilitare :
il passaggio dalle fase G0 a G1 mediante attivazione della p70 S6K, che fosforila la proteina ribosomiale S6 che stimola l’insieme di proteine ribosomiali necessarie a entrare nel ciclo cellulare. Inoltre promuove anche il passaggio dalla fase G1 a S mediante l’induzione dell’espressione della ciclina D1 e della CDK4, comportando fosforilazione del fattore Rb. Nabissi 2017

20 PI3-K pathways Nabissi 2017

21 Il pathway PI(3)-chinasi.
PI(3)K è attivato sia da RAS che da RTK e di seguito attiva diversi pathways a valle attraverso la generazione del secondo messaggero lipidico fosfatidil-inositol-3,4,5-trifosfato (PtdIns(3,4,5)P3. In particolare la famiglia di chinasi serina-treonina AKT è considerata come il principale bersaglio di PI(3)K nei tumori. Esistono tre classi di PI(3)Ks, ma sembra che solo il sottogruppo IA-PI(3)K sia coinvolto nei tumori. IA-PI(3)K sono eterodimeri composti da una famiglia di subunità regolatorie (p85) e di subunità catalitiche (p110). Nabissi 2017

22 Sono capaci di fosforilate l’anello inositolico del lipide di membrana fosfatidil-inositolo 4,5 bifosfato per generare il secondo messaggero PtdIns(3, 4, 5)P3. Inoltre le subunità p85 contengono dei domini che legano specifici residui nella regione citoplasmatica dei RTKs, questo legame permette di generare un pool locale di PtdIns(3, 4, 5)P3. Le subunità p110 possono legarsi direttamente ed attivare RAS. Una delle famiglie maggiormente attivate da PtdIns(3, 4, 5)P3 sono le serine/treonine chinasi AKT. AKT controlla il ciclo cellulare, la sopravvivenza e la crescita cellulare attraverso la fosforilazione di diversi substrati. Nabissi 2017

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24 Inibitori di PI3K e mTOR esercitano un forte autophagy-inducing effect
L’autofagia è regolata negativamente da mTOR, una serine/threonine kinase, via la formazione del complesso mTORC1 complex. Inibitori di PI3K e mTOR esercitano un forte autophagy-inducing effect Nabissi 2017

25 PTEN è una fosfatasi che lega e distrugge PIP3 convertendolo in PI(4,5)P2 o PI(3,4)P2
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26 mutazioni PTEN carcinoma mammario: inattivato 15-30%
Prostatic carcinomas – PTEN mutato negli stadi avanzati. Le cellule PTEN-negative cells diventano andrigeni resistenti E tendono a metastiizzare carcinoma mammario: inattivato 15-30% GLIOMA: mutazioni di PTEN sono indice di aggressività Carcinoma follicolare della tiroide (25%), Nabissi 2017

27 RAS RAS è un oncogene coinvolto nella proliferazione cellulare ed è composto da tre membri (H, K, N)-RAS. Sono proteine legate nel lato citoplasmatico della cellula ed il loro ruolo è quello di legate, nello stato inattivo GDP. Mutazioni puntiformi del gene Ras sono l’anomalia singola piu’comune di oncogeni trasmesse come carattere autosomico dominante. Nabissi 2017

28 Le proteine ras sono state scoperte nei virus oncogeni :
Queste proteine sono attivate dai RTK e passano continuamente da una forma inattiva legante il GDP ad una forma attiva legante il GTP. Le proteine ras sono state scoperte nei virus oncogeni : K-ras-A, K-ras.B : sarcoma murino, il proto oncogene umano nel cromosoma 12 H-ras: sarcoma murino, il proto oncogene umano nel cromosoma 11 N-ras: neuroblastoma e carcinomi umani, presente nel cromosoma 1 Il prodotto di questi geni distinti è molto simile e viene denominato p21ras Nabissi 2017

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30 Mutazioni nei geni ras hanno come conseguenza quella di ridurre l’attività GTPasica, con conseguente mantenimento del GTP e quindi prodotto attivo o mutazioni che facilitano il distacco del GDP e conseguentemente ras attivo. Il risultato finale è che ras rimane piu’ a lungo o costitutivamente attivo, stimolando la proliferazione cellulare delle cellule tumorali. Nabissi 2017

31 + + MUTAZIONE DI KRAS GTP GAP GDP GAP GTP GDP Mutant KRAS active
Inactive KRAS GTP active KRAS GAP Inactive KRAS + GDP GAP GTP + GDP Downstream signal transduction cascade Nabissi 2017

32 mutazioni attivanti RAS
mutationi RAS si riscontrano nel 30% dei tumori HRAS1 KRAS2 NRAS R-RAS Ras-mut = GAP- refractory GTPase Un’alta incidenza di mutazioni di K-RAS si riscontrano nei tumori al pancreas (70 –100%) Nabissi 2017

33 Meccanismo di trasduzione di ras
Nel citoplasma delle cellule è presente una proteina denominato GRB-2 con domini SH2/3 che gli permettono di formare un complesso con una proteina denominata SOS (che è un fattore di scambio di nucleotidi guanidilici). Quando la cellula riceve un segnale da un fattore di crescita che lega RTK, il complesso GRB-2 SOS interagisce mediante i domini SH2/3 o PTB (phosphotyrosin binding) ai residui fosforilati del RTK. Questo contatto permette il reclutamento da parte di SOS della proteina ras (che lega il GDP), questo permette lo scambio con il GTP e ras si attiva. Nabissi 2017

34 Questa attivazione comporta la fosforilazione della serina/treonina chinasi raf-1 che a sua volta fosforila una MAPKK (MEK) (Mitogen Activated Protein Kinase Kinase) che a sua volta fosforila una MAPK (ERK1/2) che trasloca nel nucleo, fosforila fattori di trascrizione, come c-fos, myc e attiva la proteina ribosomiale S6, che attivano la trascrizione di geni coinvolti nell’indurre la proliferazione cellulare o contribuiscono alla crescita cellulare. Quando ras lega il GTP assume un cambiamento conformazionale che comporta anche il reclutamento delle GTP-asi activating protein (GAPs) come la p120GAP e la neurofibromina1 (NF1) che riportano ras nella forma legante il GDP. NF-1 Nabissi 2017

35 EGF RECEPTOR Nabissi 2017

36 EGF-R EGF-R ha un ruolo importante nell’ambito di diverse patologie tumorali in quanto la sua attivazione costitutiva lo rende responsabile dell’attivazione di meccanismi di proliferazione cellulare. L’omologo del protoncogene EGF-R è stato scoperto nel virus dell’eritroblastosi aviaria e denominato v-erb. L’analisi della sequenza aminoacidica di v-erb ha dimostrato che questo oncogene virale codifica per una proteina (gp65) che è simile ad una parte del EGFR, quindi è un recettore troncato della porzione extracellulare responsabile del legame a EGF, ma contenente la porzione citoplasmatica con attività tirosinchinasica che è costitutivamente attiva. I pathways principalmente attivati dall’attivazione di EGF-R sono quello di Ras/MAPchinasi e PI3 chinasi/AKT, che agiscono entrambi nella mitogenesi e sopravvivenza cellulare. Nabissi 2017

37 ATTIVAZIONE DEI SEGNALI INTRACELLULARI EGFR-DIPENDENTI
Legame del ligando specifico nella porzione extracellulare del EGFR Formazione dell’omodimero o eterodimero che causa la fosforilazione ATP-dipendente di specifici residui di tirosina nel dominio intracellulare di EGFR Attivazione dei pathways intracellulari: Ras-Raf-MEK-MAPK che controllano la progressione della fase G1/S PI3K-Akt che attiva una cascata antiapoptotica e di sopravvivenza Nabissi 2017

38 EGFR è un recettore appartenente ad una famiglia di quattro recettori.
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39 Tre diverse strategie terapeutiche per interagire con tale sistema e inibire la trasduzione dei segnali proliferativi : Uso di anticorpi monoclonali antirecettore che si legano alla porzione extracellulare della molecola recettoriale e impediscono il legame con il ligando Uso di farmaci inibitori selettivi della tirosinchinasi associata al recettore Uso di farmaci che agiscono sulle fasi piu’ avanzata della cascata della trasduzione del segnale come i farmaci che interagiscono con le proteine della famiglia RAS (inibitori della farnesiltrasferasi) Nabissi 2017

40 Meccanismo d’azione dei farmaci Anti-EGFR
Le conseguenze sono: - Arresto delle cellule in fase G1 con incremento di p27 (inibizione delle CDK) Inibizione dell’angiogenesi tramite il blocco della sintesi di TGFa, VEGF, IL-8, FGF. inibizione dell’invasività e delle metastasi Nabissi 2017

41 Meccanismo dei Anti-EGFR Monoclonal Antibodies.
L’anti-EGFR cetuximab, che è una immunoglobulina IgG1 induce immunorisposta anticorpo dipendente, citotossicità cellulo-mediata (Panello A). Inoltre gli anticorpi anti-EGFR inducono internalizzazione del recettore e down-regolazione incrementando la sua degradazione (Panello B). Nabissi 2017

42 Nella FISH il centromero del cromosoma 17 e' marcato con un segnale fluorescente verde e il gene HER-2 con un segnale fluorescente arancio. In breve si contano circa 60 nuclei cellulari e in ognuno di essi si fa il rapporto tra segnale verde e segnale arancio.Il tumore e'definito "positivo" per l'amplificazione genica quando il rapporto gene/cromosoma e'>2 Nabissi 2017

43 Percentuali di tumori EGFR+
Tipo di Neoplasia % espressione EGFR Vescica 31-48% Mammella 14-91% Utero 90% Colon 25-77% Esofago 43-88% Stomaco 4-33% Glioma 40-63% Testa-collo 80-100% Ovaio 35-70% Pancreas 30-89% Prostata 40-85% Rene 50-90% Polmone 40-80% Nabissi 2017

44 INIBITORI DELLE TIROSINCHINASI
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45 REGOLAZIONE DELL’ATTIVITA DELLE TK
TKs sono divise in due classi, recettori TKs transmembrana con dominio attivatore extracellulare e dominio catalitico intracellulare e TKs citoplasmatiche che mancano del dominio extracellulare che si trovano nel citoplasma, nucleo e membrane interne. L’attività delle TK è regolata in modo tale che in condizioni non proliferative sono defosforilate, perchè è assente il ligando. Le TK-non recettori associate sono mantenute in uno stato inattivo da inibitori cellulari e stimoli di diversa natura dissociano questi inibitori e inducono la fosforilazione mediante altre chinasi. L’azione delle chinasi è terminata dalle fosfatasi che idrolizzando il fosfato presente sulla tirosina ed inducono gli inibitori. Nabissi 2017

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47 Un meccanismo comune nei tumori ematologici è l’attivazione delle TK mediante la fusione di un recettore o non recettore TK con una proteina partner, come conseguenza di una traslocazione cromosomica. Un aspetto frequente della proteina partner è un dominio che causa una oligomerizzazione costitutiva della TK in assenza di ligando, promovendo autofosforilazione ed attivazione. BCR-ABL nella CML (leucemia mielodie cronica), dove si genera una proteina chimerica che costituisce una TK costitutivamente attiva. Mutazioni della chinasi FLT3 nella leucemia mieloide acuta (AML) che rende la TK attiva in assenza di ligando. Nabissi 2017

48 Il cromosoma Philadelphia
Leucemia Mieloide Cronica (LMC) Il cromosoma Philadelphia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 x Y Presente in oltre il 95% dei pazienti affetti da LMC Nabissi 2017

49 Leucemia Mieloide Cronica
Rappresentazione schematica del cromosoma Philadelphia (Ph) Leucemia Mieloide Cronica La traslocazione t (9;22) Cromosoma Cromosoma 9 9+ Cromosoma Cromosoma 22 Ph bcr Bcr-Abl abl Proteina di fusione con elevata attività tirosina-chinasica La fusione BCR-ABL durante la traslocazione e’ associata a un notevole aumento dell’attività tirosinchinasica di ABL e da’ a quest’ultima la capacità di legare il sito SH2 di attacco a GRB2. Nabissi 2017

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51 Meccanismi di resistenza secondaria all’Imatinib
Mutazioni di BCR-ABL Aumentato efflusso dalla cellula (glicoproteina MDR) Iperespressione di BCR-ABL Alterazioni genetiche aggiuntive Nabissi 2017

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53 ONCOSOPPRESSORI Nabissi 2017

54 Geni oncosoppressori Geni la cui mancata attività all’interno della cellula favorisce la crescita tumorale. L’alterazione nella struttura o nell'espressione di questi geni (inattivazione) se è a carico di entrambi gli alleli determina perdita di funzione e fenotipo tumorale. ● Inibitori della crescita (TGF-beta) ● Recettore di inibitore (TGF-beta Receptor) ● Inibitore di trasduttore del segnale (NF1, PTEN) ● Inibitori dei fattore di trascrizione (Rb) ● Inibitori del ciclo cellulare (CDKI, p16, p21) ● Fattori apoptotici (Bad, Bax) Nabissi 2017

55 ● Funzione di controllo dell’integrità del genoma (p53)
Corretta duplicazione del genoma Riparazione del DNA • BRCA-1 Integrità del genoma (stabilità cromosomi riparazione DNA) • BRCA-2 Integrità del genoma (stabilità cromosomi, riparazione DNA) • NER Integrità del genoma (riparazione DNA per escissione dei nucleotidi) • MSH2 Integrità del genoma (riparazione DNA da errato appaiamento) ATM Integrità del genoma attiva sistemi riparazione, attiva p53, rallenta ciclo mitotico in fase G2 Nabissi 2017

56 Meccanismi di inattivazione di geni oncosoppressori
Perdita del prodotto o formazione di prodotto inattivo (troncato) a causa di ● Delezione (perdita gene, perdita intero cromosoma) ● Mutazione (non senso, di senso, frameshift) ● Epigenetica (es metilazione) (ipermetilazione del promotore di MLH1 impedisce il mismatch repair) ● Prodotti virali Nabissi 2017

57 TP53 Nabissi 2017

58 TP53 p53 funziona principalmente come fattore trascrizionale e controlla l’espressione di un ampio spettro di geni, coinvolti nelle piu’ disparate funzioni. p53 è spesso mutato nei tumori. Mutazioni che producono un p53 troncato o malfunzionante o mutazioni che interferiscono con il DNA Binding Domain sono predizione di una pessima diagnosi. Nabissi 2017

59 Per quanto la perdita o mutazioni in p53 sia associate ad un incremento della suscettibilità a sviluppare un tumore, topi -/- per p53 sviluppano normalmente e altre osservazioni indirizzano p53 anche verso un ruolo nella normale fisiologia cellulare. Questi studi includono il ruolo di p53 nel regolare la longevità e l’invecchiamento, la glicolisi e la risposta apoptotica dopo ischemia, la sopravvivenza cellulare dopo danni genotossici o stress ossidativo, angiogenesi, rimodellamento osseo ed autofagia. Nabissi 2017

60 TP53 Mutazioni Germinali predispongono a diversi tipi di cancro
Tumor spectrum in TP53 mutation carriers Breast 28.9 Soft tissues 16 >80% 15.4 Brain Bones 12.8 Adrenal gland 6.8 Lung 3.4 Leuk/Lymph. 3.2 Stomach 2.5 Colorectum 1.7 Skin 1.5 Ovary 1.5 Other 5.9 5 10 15 20 25 30 Nabissi 2017

61 TP53 è un oncosoppressore
% topi con tumore p53+/+ 1% at 18 mesi p53+/- 2% at 9 mesi p53-/- 75% at 6 mesi Nabissi 2017

62 Mutazioni in p53 Nabissi 2017

63 quali riconoscono il DNA danneggiato.
ATTIVAZIONE di p53 Il funzionamento di p53 è regolato da alcune proteine effettrici: ATM e ATR, le quali riconoscono il DNA danneggiato. ATM e ATR attivano le chinasi CHK2 e CHK1. CHK1 attraverso una serie di processi inibisce le CDKs, mentre CHK2 come ATM stesso attivano p53, il quale a sua volta attiva p21/waf (bloccando la proliferazione), attiva geni pro-apoptotici (Bad, Bax, PUMA, …) ed attiva GADD45 (growth arrest and DNA-damage inducible). Se il DNA viene riparato p53 attiva il suo inibitore MDM2, che a sua volta lega p53 e lo porta a degradazione. Se il danno non viene riparato p53 attiva il processo di apoptosi. Nabissi 2017

64 ATM e ATR fosforilano p53 arrestando la fase G1/S
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65 La famiglia Cip/Kid è composta da tre mebri : p21Waf, p27 e p57.
I meccanismi che controllano il passaggio dalla fase G1 alla S, consistono anche di processi d’inibizione della proliferazione cellulare, i quali regolano l’attività dei complessi C/CDK. Le due principali classi d’inibitori sono fattori proteici della famiglia Cip/Kid e INK4/Arf. La famiglia Cip/Kid è composta da tre mebri : p21Waf, p27 e p57. p57 funziona come freno all’interno del ciclo cellulare, mentre p21/waf sono principalmente dei mediatori di segnali citostatici. Ink4 e Arf agiscono rispettivamente bloccando il ciclo cellulare ed agendo sul fattore trascrizionale p53. Nabissi 2017

66 Inibizione di P53 MDM2 associata con p53 TAD MDM2-binding comporta
1. Repressione della transattivazione 2. Destabilizzazione di p53 in quanto MDM2-binding stimola degradazione di p53 Nabissi 2017

67 p53 and MDM2 formano un feedback loop autoregolatorio.
p53 stimola l’espressione di MDM2; MDM2 inibisce p53 bloccando la sua attività trascrizionale, favorendo la sua degradazione. DNA damage favorisce la fosforilazione di p53, prevenendo la sua associazione con MDM2. ARF, previene la degradazione di p53 MDM2-mediata. Quindi inibitori dell’interazione p53–MDM2 possono attivare p53 nei tumori esprimenti p53. Nabissi 2017

68 Diverse strategie per rompere il legame MDM2-p53
Prima dell’attivazione attivato fosforilazione  Rottura del legame attivazione  fosforilazione Inattivata l’azione di E3 Activated  ARF-binding  inactivated E3-act Nabissi 2017

69 Se la riparazione del DNA non viene effettuata allora p53 puo’ indurre apoptosi attraverso l’attivazione di geni proapoptotici della famiglia Bcl-2, Fas e repressione di geni anti-apoptotici. L’azione di p53 come fattore responsabile del blocco del ciclo cellulare o dell’attivazione dell’apoptosi sembra sia regolata dai sui livelli all’interno della cellula. Bassi livelli inducono blocco del ciclo cellulare mentre alti livelli l’apoptosi. Nabissi 2017

70 Bersaglio: Microambiente
La necessità per i tumori di rifornirsi di nutriente puo’ essere contrastata con farmaci antiangiogenetici, come nell’uso di anticorpi monoclonali contro il VEGF, nel trattamento del cancro al colon, ma è un’approccio che potrebbe essere applicato in molti tumori. Inoltre la terapia che agisce piu’ sull’ospite (cellule endoteliali) che sul tumore è sicuramente meno soggetta a resistenza farmacologica, in quanto le cellule normale hanno sicuramente meno plasticità genetica delle tumorali. Studi recenti riguardanti le interazioni tumore-stroma rivelano un complesso scambio d’informazioni che non riguardano solo la vascolarizzazione. Lo stroma comprende oltre ai fibroblasti un numero elevato di cellule infiammatorie che possono chiaramente influenzare la crescita del tumore. Uno dei fattori stromali maggiormente studiato è TGF-b, il quale svolge diversi ruoli che possono influenzare positivamente o negativamente la crescita tumorale. Nabissi 2017 70

71 TGF-beta (TGF-b) Nei tessuti, l’omeostasi richiede un bilanciamento delle interazioni fra le cellule e la matrice extracellulare. Queste interazioni cooperative coinvolgono numerose citochine che agiscono attraverso specifici recettori di membrana. Quando il bilanciamento tra cellule e matrice extracellulare è perturbato si possono sviluppare diverse patologie. Questo fenomeno è particolarmente evidente per il TGF-b che è un membro della famiglia di fattori di crescita che include la proteina morfogenetica ossea e l’activina. Quasi tutti i tipi di cellule producono TGF-b ed hanno i recettori per il TGF-b il quale regola la proliferazione e la differenziazione delle cellule, lo sviluppo embrionale, la riparazione delle ferite e l'angiogenesi. Nabissi 2017

72 Il ruolo essenziale del TGF-b, dimostrato in diversi esperimenti, dimostra che l'incremento o decremento di TGF-b è legato a diversi tipi di patologie, fra cui il cancro. Ci sono tre isoforme di TFG-b (1, 2, 3) ognuna codificata da geni distinti ma strutturalmente altamente conservate ma differenti nell’affinità di legame al recettore. Il TGF-b è sintetizzato come un largo precursore contenente una regione che viene tagliata prima della secrezione del precursore, ma che rimane attaccata mediante legami non covalenti. Una volta secreto il TGF-b viene immagazzinato nella matrice extracellulare, in un complesso comprendente una proteina di legame (TGF-b binding protein, TGFBP), che ne evita il legame al recettore. Il TGF-b viene poi rilasciato mediante una glicoproteina di matrice (trombospondina-1) la quale cambia la conformazione della TGF-b BP. Il TGF-b attivo agisce su tre tipi di recettori (I, II, III), ma i tipi I e II sono quelli specifici solo per TGF-b. Nabissi 2017

73 Contatto cellula-cellula, proteasi, trombospondina
TGF-β è immaganizzato nella ECM in forma inattiva complessato con beta-glicani e decorina Dopo il taglio TGF-β forma omodimeri via legami S-S precursore maturo Tagliato ma ancora legato alla ECM TGFBP TGF-β attivo puo’ essere rilasciato tramite acidificazione Contatto cellula-cellula, proteasi, trombospondina Nabissi 2017

74 I recettori di tipo II e II contengono delle chinasi serina-treonina nel loro dominio intracellulare che attivano la fosforilazione di diversi fattori di trascrizione conosciuti come SMAD (10 membri). SMAD2 e SMAD3 sono fosforilati mediante attivazione del TGF-RI, SMAD4 è un partner comune di tutti gli SMAD attivati da recettori, mentre SMAD6 e SMAD7 bloccano la fosforilazione di SMAD2 e SMAD3, inibendo così il segnale attivato da TGF-b. Un meccanismo generale dell’azione del TGF-b, consiste nel legame del TGF-b al TGF-RII che recluta, lega e fosforila il TGF-RI il quale stimola l’attività chinasica. che fosforila SMAD2 o SMAD3 i quali formano un complesso che migra nel nucleo e lega altri fattori trascrizionali regolando la trascrizione di specifici geni Nabissi 2017

75 TGF-β /SMAD Nabissi 2017

76 Ruolo del TGF-b nel cancro
Regolazione del ciclo cellulare ed effetto sulla proliferazione. Nelle cellule ematopoietiche, endoteliali ed epiteliali il TGF-b è un potente inibitore della proliferazione cellulare, stimolando la sintesi delle CDKI (p15) ed inibendo le funzioni e la produzione delle CDK2, CDK4, ciclina A ed E. Questi effetti risultano in una riduzione della fosforilazione di Rb, bloccando cosi’ l’attivazione dei fattori E2F. Nei tumori le mutazioni a carico del pathway TGF-b, comportano una proliferazione incontrollata. Questa perdita nel controllo della proliferazione ha come conseguenza anche un’induzione della secrezione di TGF-b da parte dei fibroblasti, che agisce (essendo le cellule tumorali resistenti) sugli stessi fibroblasti, sul sistema immunitario, sulle cellule endoteliali e sulla muscolatura liscia causando immunosoppressione, angiogenesi e stimolando l’invasività del tumore. Nabissi 2017

77 Nabissi 2017

78 Stimola l’espressione dei CDKI come p15 e p21e reprime l’espressione di c-myc
TGF-β L’ arresto è mediato dalla down-regolazione di Myc, il quale rilascia Miz1. Miz1 si lega al promotore del p15 e lo attiva in co-operazione con il complesso Smad. Nabissi 2017

79 Carcinomi Smad4 +/- Apc +/- mostrano
proliferazione delle cellule stromali e forte invasione tissutale. Nabissi 2017

80 Effetto sulle metastasi
TGF-b è uno dei piu’ potenti stimolatori della produzione e deposizione della matrice extracellulare. Stimola la produzione e influenza le proprietà adesive della matrice extracellulare, attraverso principalmente due meccanismi. TGF-b stimola i fibroblasti ed altre cellule a produrre le proteine della matrice extracellulare e le proteine di adesione cellulare, incluso il collagene, fibronectina ed integrine. Secondo, TGF-b decrementa la produzione di enzimi che degradano la matrice extracellulare, incluso collagenasi, eparinasi e stromelisine ed incrementa la produzione di proteine che inibiscono gli enzimi che degradano la matrice extracellulare come gli inibitori dell’attivatore del plasminogeno e gli inibitori delle metalloproteasi (TIMPs). Nei tumori TGF-b è aumentato e la sua azione induce stimolazione delle molecole di adesione cellulare, stimolando l’invasività e l’angiogenesi. Nabissi 2017

81 Effetti immunosoppressivi
TGF-b che è prodotto da tutti i leucociti, promuove la loro differenziazione ed inibisce la proliferazione ed attivazione. Sopprimendo la proliferazione leucocitaria, induce una diminuzione di cellule del sistema immunitario, suggerendo un ruolo del TGF-b nell’aiutare il tumore a sfuggire dalla immunosorveglianza. Nabissi 2017