Focalizzazione isoelettrica (IEF)

Presentazione sul tema: "Focalizzazione isoelettrica (IEF)"— Transcript della presentazione:

1 Focalizzazione isoelettrica (IEF)
Separa le proteine in base al loro pI, che può variare anche solo unità di pH. Anfoliti = acidi poliammino-policarbossilici sintetici Molecole anfotere a basso peso molecolare Sottoposte ad un campo elettrico migrano a seconda della loro carica fino al pI Per la loro elevata capacità tamponante in ogni punto del gel il valore di pH sarà bene preciso

2 (ISOELECTRIC FOCUSING)
IEF (ISOELECTRIC FOCUSING) La separazione viene condotta secondo un gradiente di pH, stabilito tra due elettrodi e stabilizzato dalle anfoline La continua produzione di H3O+ e OH- agli elettrodi causa un’innalzamento del pH al catodo (-) e una caduta all’anodo (+) anodo (+) (-) catodo pH

3 A- A+ Distanza A è una molecola anfoterica con pI=pH’ pH > pH’ = A-
anodo (+) (-) catodo In corrispondenza del pI (pH’) si forma un piccolo plateau di pH pH’ anodo (+) (-) catodo Con diverse sostanze anfoteriche, o anfoline, il gradiente di pH si linearizza Distanza anodo (+) (-) catodo

4 Isoelettrofocalizzazione in gradienti di pH immobilizzati
Le IMMOBILINE sono derivati della acrilammide, contenenti catene laterali con capacità tamponanti , che vengono polimerizzate nel gel insieme alla acrilammide. Le immobiline hanno la struttura generale O CH2=CH-C-NH-R dove R contiene sia gruppi carbossilici che amminici. La copolimerizzazione di questi monomeri con diverso pKa in diversa concentrazione permette di creare dei gradienti preformati di pH all'interno del gel. =

5 Per ogni pH diverso dal punto isoelettrico (pI) le proteine portano una carica netta e quindi potranno migrare in un campo elettrico pH < pI pH = pI pH > pI Una proteina in soluz con pH < pI acquista carica positiva e migrerà verso il catodo (-) Una proteina in soluz con pH > pI migrerà verso l’anodo (+) pH<pI + - pH>pI pH=pI le proteine possiedono una carica netta nulla, quindi non migrano più Gradiente di pH

6 Focalizzazione isoelettrica (IEF) di proteine con attività perossidasica di foglie di pioppo (Populus deltoides x maximowiczii, clone I-214, res, e Eridano, sens) esposte a 60 ppb di ozono per 5 h al giorno per 15 giorni (O3) o ad aria filtrata (C). C O3 C O3 RES SENS anodo (+) catodo (-)