CINETICA ENZIMATICA.

Presentazione sul tema: "CINETICA ENZIMATICA."— Transcript della presentazione:

1 CINETICA ENZIMATICA

2 EFFICIENZA ENZIMATICA
Velocità delle reazioni enzimatiche TUTTI GLI ENZIMI POSSONO ESSERE ANALIZZATI IN MODO DA POTER QUANTIFICARE SIA LA VELOCITA’ DI REAZIONE CHE LA LORO EFFICIENZA ENZIMATICA Lo studio della cinetica enzimatica inizia nel 1909 con ADRIAN BROWN e i sui studi sulla velocità di IDROLISI del SACCAROSIO catalizzata dall’enzima -fruttofuranosidasi SACCAROSIO + H2O GLUCOSIO + FRUTTOSIO Quando la concentrazione del saccarosio è molto più elevata di quella dell’enzima, la velocità di reazione diventa indipendente dalla concentrazione del saccarosio

3 cinetica temporale [E]
[E] V0 = NUMERO DI MOLI DI SUBSTRATO CHE SI CONSUMANO IN UN SECONDO AD UNA CONCENTRAZIONE FISSA DI ENZIMA V0 = NUMERO DI MOLI DI PRODOTTO CHE SI FORMANO IN UN SECONDO AD UNA CONCENTRAZIONE FISSA DI ENZIMA cinetica temporale Leonor Michaelis e Maud Menten nel 1913 proposero un semplice modello matematico per spiegare queste caratteristiche cinetiche Velocità a differenti concentrazioni di S

4 La reazione raggiunge velocemente l’equilibrio
Velocità delle reazioni enzimatiche Il punto focale dell’ipotesi di Michaelis e Menten sta nella formazione di un COMPLESSO ES SPECIFICO come intermedio essenziale per la catalisi COMPLESSO ENZIMA-SUBSTRATO Michaelis e Menten proposero che la REAZIONE ENZIMATICA COMPLESSIVA fosse costituita da due REAZIONI ELEMENTARI E + S ES P + E K1 K2 K3 La reazione raggiunge velocemente l’equilibrio Reazione limitante perché la più lenta

5 Velocità delle reazioni enzimatiche
Questi scienziati attraverso una serie di assunzioni logiche vogliono determinare un equazione della velocità che metta in relazione la velocità di reazione alla concentrazione del substrato in una reazione catalizzata da un enzima. Vogliono cioè ricavare l’equazione della velocità che sia valida per una qualsiasi reazione catalizzata da un qualsiasi enzima

6 Velocità delle reazioni enzimatiche
LA PRIMA ASSUNZIONE ( assunzione dell' "equilibrio rapido") dice che il complesso ES è in equilibrio con l’E libero e il S e che questa situazione di equilibrio non è disturbata dalla formazione del P. In altre parole la velocità di formazione del prodotto a partire da ES è molto piccola rispetto alla velocità con cui ES si scinde per dare E+S ( k3 << k2 ). La velocità di catalisi è data dalla formazione del prodotto (reazione più lenta) d[P] V = dt = K3[ES]

7 Velocità delle reazioni enzimatiche
LA SECONDA ASSUNZIONE (assunzione della velocità iniziale V0 ) la velocità della reazione viene valutata per un periodo di tempo durante il quale la reazione inversa è fisicamente trascurabile in quanto poco è il prodotto formatosi: la velocità iniziale che può così essere determinata sarà la massima velocità ottenibile. In condizioni di velocità iniziale la reazione è di fatto irreversibile (k4=0) e deve essere scritta nel seguente modo:

8 Velocità delle reazioni enzimatiche
LA TERZA ASSUNZIONE (assunzione dello "stato stazionario“) Dice che il complesso ES si mantiene in uno stato stazionario durante tutto il periodo di tempo in cui si possono misurare le velocità iniziali. [ES] rimane costante per cui la velocità con cui il complesso ES si forma a partire da E+S è uguale alla somma delle velocità con cui si scinde per dare E+P ed E+S.

9 Stato Prestazionario e Stato Stazionario

10 Stato Prestazionario e Stato Stazionario

11 Velocità delle reazioni enzimatiche
ASSUNZIONE DELLO STATO STAZIONARIO [S] >> [E] Velocità di sintesi di ES rimane COSTANTE equazione di conservazione di massa per l'enzima: STATO STAZIONARIO v di SINTESI = v di CONSUMO

12 Velocità delle reazioni enzimatiche
COME SI ARRIVA ALL’EQUAZIONE DELLA VELOCITA’ V0 =K3[ES] La concentrazione di ES deve essere scritta in termini di concentrazioni note

13 Velocità di formazione di ES Velocità di scissione di ES
Velocità delle reazioni enzimatiche Velocità di formazione di ES Velocità di scissione di ES = Velocità di formazione di ES [ES]= K1[E] [S] Velocità di scissione di ES [ES]= (K2+K3) [ES] d[ES] dt = 0 K1 [E] [S] = K3 [ES] + K2 [ES]

14 Velocità delle reazioni enzimatiche
Svolgiamo l’equazione portando le costanti tutte dalla stessa parte K1 [E] [S] = K3 [ES] + K2 [ES] = [E] [S] [ES] (K3 + K2) K1 COSTANTE DI MICHAELIS [E] [S] [ES] KM = (K3 + K2) K1 = KM Per poter essere utilizzate le espressioni CINETICHE devono essere formulate in quantità note Poiché [E]T = [E] + [ES] [E] = [E]T - [ES] ([E]T – [ES])[S] [ES] KM = sostituendo

15 Velocità delle reazioni enzimatiche
([E]T – [ES])[S] [ES] KM = Risolvendo rispetto a ES [ES] KM = [E]T [S]– [ES][S] [ES] KM + [ES][S] = [E]T [S] [ES] = [E]T[S] KM + [S] [ES] (KM + [S]) = [E]T [S] Poiché la velocità iniziale è data da d[P] V0 = dt = K3[ES] [ES] = V0 / K3 = K3[E]T[S] KM + [S] V0 Sostituendo a [ES] l’equazione diventa:

16 Equazione di una iperbole
Equazione di Michaelis-Menten QUANDO [S]>> [E] TUTTO L’ENZIMA E’ SATURATO [ES] [ET] V0= K3[ES] V0= K3[ET] VMAX = K3[ET] = K3[E]T[S] KM + [S] V0 v0 = VMAX [S] KM + [S] Equazione di una iperbole EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN

17 Equazione di Michaelis-Menten
v0 = VMAX [S] KM + [S] VMAX diventa l’ asintoto a cui tende l’iperbole e KM ?

18 Equazione di Michaelis-Menten
v0 = VMAX [S] KM + [S] Se VMAX è il valore dell’asintoto a cui tende l’iperbole, a che valore corrisponde la KM ? quando V0 = VMAX/2 VMAX VMAX [S] KM + [S] 2 = VMAX (KM + [S]) = 2 VMAX [S] KM + [S] = 2 [S] KM = [S] La KM equivale alla concentrazione del substrato quando la velocità è uguale a VMAX/2

19 Equazione di Michaelis-Menten
Per concentrazioni di substrato basse [S]<<Km l'equazione di Michaelis-Menten diviene l'equazione della retta: v0 = VMAX [S] KM + [S] Per concentrazioni di substrato [S]>>Km l'equazione di Míchaelis-Menten si semplifica nella relazione:

20 Grafico di Lineweaver e Burk o Grafico dei doppi reciproci
Equazione di Michaelis-Menten ANALISI DEI DATI CINETICI L' equazione di Michaelis-Menten può però essere manipolata per ottenere l' equazione di una retta in cui Vmax e Km siano delle intercette e non più degli asintoti. Grafico di Lineweaver e Burk o Grafico dei doppi reciproci Trasforma l’equazione di un iperbole nell’equazione di una retta v0 = VMAX [S] KM + [S] 1 V0 = KM + [S] VMAX [S] 1 V0 = KM VMAX [S] + [S] 1 V0 = KM VMAX S + Y = m X + c Equazione lineare rispetto a 1/v0 e 1/S

21 Equazione di Michaelis-Menten
Equazione di una retta SVANTAGGI: 1) la maggior parte delle misure sperimentali di [S] sono concentrate nella parte sinistra del grafico. 2) piccoli valori di [S] piccoli errori in v0 Grandi errori in KM e VMAX Grandi errori 1/v0

22 La KM ha un valore unico per ciascuna coppia ENZIMA-SUBSTRATO
Equazione di Michaelis-Menten KM La KM ha un valore unico per ciascuna coppia ENZIMA-SUBSTRATO CORRISPONDE ALLA CONCENTRAZIONE DI SUBSTRATO IN CUI LA VELOCITA’ DI REAZIONE E’ META’ DELLA VELOCITA’ MASSIMA

23 Costante di EQUILIBRIO
significato della Km K3 << K1 quando = KS K2 KM = K1 KM = (K3 + K2) K1 Costante di EQUILIBRIO Capacità di incontrare il substrato KM = KS Quando K1> K2 KM bassa alta affinità Quando K1<K2 KM alta bassa affinità

24 LA KM MISURA L'AFFINITA' DEL SUBSTRATO PER L'ENZIMA
significato della Km LA KM MISURA L'AFFINITA' DEL SUBSTRATO PER L'ENZIMA Rappresenta la capacità dell’enzima di legare il substrato A più alta (Km2) o più bassa (Km1) concentrazione di substrato ottengo la stessa V0 = VMAX/2 La KM ha un valore unico per ciascuna coppia enzima-substrato

25 significato della Km Significato pratico della Km.
Il valore della Km è importante per varie ragioni: La Km rappresenta approssimativamente il valore della concentrazione intracellulare del substrato.

26 significato della Km La Km è una costante specifica per ogni enzima, il suo valore numerico ci fornisce un mezzo per comparare enzimi provenienti da organismi diversi, da differenti tessuti dello stesso organismo o dallo stesso tessuto a differenti stadi di sviluppo: se due enzimi hanno valori differenti di Km è probabile che siano due ISOENZIMI. Spesso ligandi differenti dal substrato provocano modificazioni del valore della Km. Se la Km determinata in vitro sembra essere troppo alta, allora è pensabile che in vivo sia presente un inibitore che ne abbassi il valore ad una livello 'fisiologico'. Se si conosce il valore della Km di un enzima, allora è possibile misurarne la velocità di reazione in condizioni di [S] di saturanti.

27 Costante catalitica = K cat COSTANTE CATALITICA VMAX = K3[E]T Vmax
KM In realtà il valore della VMAX non è una costante ma dipende dalla quantità di enzima che è stata messa per calcolare l’equazione di Michaelis-Menten. MA poichè: VMAX = K3[E]T = K cat K 3 = Vmax ET moli/sec moli COSTANTE CATALITICA Misura la velocità di un processo catalitico ( a carico di una molecola enzimatica) ed ha le dimensioni: sec-1 è anche chiamata: NUMERO DI TURNOVER Numero di molecole di substrato trasformate da una molecola enzimatica in un secondo

28 Efficienza catalitica
Nella cellula la maggior parte degli enzimi non si trova mai a concentrazione di substrato saturante ma a concentrazioni che determinano una velocità che varia tra il 10-50% di quella massima Quando [S] << KM V0 = Vmax [S] KM + [S] V0 = Vmax [S] KM Kcat = Vmax ET Vmax = Kcat [ET] V0 = [E][S] Kcat KM [E]  [E]T [ES]molto piccolo La velocità diventa la probabilità dell’enzima di trovare il substrato e il valore Misura l’efficienza catalitica di un enzima Kcat/KM

29 Efficienza che si avvicina a quella massima
Efficienza catalitica A bassa concentrazione di substrato V0 = Kcat KM [E][S] L’efficienza catalitica diventa La capacità di E e di S di collidere La TEORIA DELLA DIFFUSIONE dice che esiste un valore teorico della capacità di incontro di due molecole e questo valore è di (moli/l)-1 s-1 La trioso isomerasi che catalizza la reazione di isomerizzazione della G3P a DHAP possiede un valore di Kcat/KM = 2,4 x 108 (mol/L)-1 sec-1. Efficienza che si avvicina a quella massima

30 Efficienza catalitica
La maggior parte delle reazioni enzimatiche ha più substrati per ognuno possiamo calcolare la l’efficienza catalitica Da questi dati è abbastanza evidente che la chimotripsina ha una predilezione ad operare l’idrolisi in prossimità dei residui maggiormente idrofobici

31 Complesso multienzimatico
Efficienza catalitica La velocità di reazione è limitata solo dalla velocità con cui riescono ad incontrare il substrato in soluzione. I limiti imposti dalla velocità di diffusione possono essere superati mediante strutture polienzimatiche Complesso multienzimatico

32 quel meccanismo deve essere scartato
MECCANISMI DI REAZIONE Gli studi di CINETICA STAZIONARIA non danno informazioni sulla velocità di formazione o quella di scissione né sulla natura del complesso ES né se esistano uno o più complessi. E + S  ES  EX  EP  E + P OPPURE E + S  ES EP  E + P EX EY Tuttavia se i DATI CINETICI non sono compatibili con un certo meccanismo molecolare allora quel meccanismo deve essere scartato

33 Unità di attività enzimatica e dosaggi
degli Enzimi Catal (kat): è la quantità di enzima che converte 1 mole di reagente nel prodotto in 1 secondo nelle condizioni di reazione standard (ottimali). L’Unità internazionale (U): corrisponde alla quantità di enzima che converte 1 mole di reagente nel prodotto in 1 minuto. Poiché 1 mole /min = 1.67 10-8 moli /s quindi U = 1.67 10-8 kat. L’attività specifica: è il rapporto tra il numero di U o di Kcat e la quantità totale di proteina espressa in milligrammi.

34 Attività specifica L’attività specifica è una misura del grado di purificazione dell’enzima e il suo valore tende a raggiungere un massimo e rimane poi costante quando tutte le molecole del campione in esame sono molecole di enzima attivo.

35 Effetto del pH L’attività enzimatica è influenzata dal pH. Ciò può derivare dai valori di pKa del substrato e/o dell’enzima. Perciò il pH scelto e la selezione di un tampone appropriato sono fondamentali per i saggi di attività enzimatica.

36 Effetto della temperatura temperatura
Le reazioni enzimatiche, come le reazioni chimiche, dipendono dalla temperatura, inoltre se la temperatura diventa troppo alta l’enzima può denaturarsi e si avrà perdita di attività.

37 INIBIZIONE ENZIMATICA
La formazione reversibile di un legame non covalente con una molecola diversa dal substrato porta alla formazione di complessi anomali, che non fanno parte del normale processo catalitico. Nella trattazione cinetica della inibizione enzimatica si applicano le assunzioni di Michaelis-Menten anche all'inibitore. Ci sono almeno tre tipi principali di inibizione. Ogni sostanza che riduca la velocità di una reazione enzimatica è da considerarsi un inibitore.

38 Legame non covalente tra inibitore e enzima
INIBIZONE ENZIMATICA Le sostanze che alterano l’attività di un enzima legandosi ad esso, sono chiamate INIBITORI INIBIZIONE IRREVERSIBILE REVERSIBILE Legame non covalente tra inibitore e enzima Legame covalente tra inibitore e enzima INATTIVATORI Azione di tossine e veleni specifici, molti dei quali provocano la morte inattivando degli enzimi chiave.

39 inibizione reversibile
INIBIZIONE COMPETITIVA INIBIZIONE NON COMPETITIVA INIBIZIONE INCOMPETITIVA Sostanza che compete con il substrato per il SITO ATTIVO Sostanza che si lega ad un SITO DIVERSO dal sito attivo INIBITORE COMPETITIVO INIBITORE NON COMPETITIVO INCOMPETITIVO

40 INIBIZIONE COMPETITIVA
L’inibitore che somiglia al substrato lega l’enzima nel SITO ATTIVO, ma diversamente dal substrato non è capace di reagire per dare un prodotto di reazione. E + S  ES  E + P + I  E I K1 K3 K2 KI In presenza dell’INIBITORE l’enzima non può legare il substrato come di consueto. L’Enzima opera come se la sua KM per il substrato fosse aumentata [E]t = [E] [ES] [EI] Enzima totale Enzima libero Enzima legato al substrato all’inibitore

41 STESSA Vmax DIVERSA KM

42 UN INIBITORE COMPETITIVO RIDUCE LA CONCENTRAZIONE DI ENZIMA LIBERO DISPONIBILE PER LEGARE IL SUBSTRATO Per tutto il tempo che l’inibitore occupa il sito attivo, l’enzima non è disponibile per la catalisi aumenta la KM

43 Un inibítore competitivo è una sostanza che si lega all'enzíma libero, impedendo così la formazione del complesso enzima-substrato. Esso può essere un analogo non metabolizzabile del substrato, un substrato alternativo per l'enzima o un prodotto di reazione. L'inibizione della succinico deidrogenasi da parte dell'acido maloníco è un classico esempio di inibizione competitiva da analogo non metabolízzabile:

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45 INIBITORE NON COMPETITIVO molecola che non somiglia al substrato
INIBIZIOMNE NON COMPETITIVA Quando l’inibitore si lega ad un SECONDO SITO sulla superficie dell’enzima diverso dal SITO ATTIVO modificando la Kcat INIBITORE NON COMPETITIVO molecola che non somiglia al substrato

46 L’inibitore si lega tanto ad E che a ES e che S si lega sia ad E che a EI. La presenza di uno di essi non ha alcun effetto sulla costante di dissociazione dell'altro, ma il complesso ESI è inattivo, non è in grado cioè di liberare il prodotto. L’inibitore non competitivo si comporta come se determinasse una rimozione di molecole enzimatiche attive dalla soluzione KM uguale VMAX VARIA

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48 INIBIZIONE INCOMPETITIVA
L’inibitore si lega direttamente al complesso ES ma non all’enzima libero E + S  ES  E + P K1 K2 K-1 + I ESI KI Nessuna reazione L’inibitore incompetitivo, che non deve necessariamente somigliare al substrato provoca una distorsione nel sito attivo, rendendo l’enzima cataliticamente inattivo Varia sia VMAX che KM L’inibitore influenza la funzione catalitica dell’enzima, ma non il suo legame con il substrato. Importante solo per gli enzimi a substrati multipli.

49 E' interessante notare che per l’inibizione incompetitiva, il grado di inibizione aumenta all'aumentare della concentrazione del substrato. Ciò è comprensibile in quanto l'inibitore incompetitivo si lega al solo complesso ES, e la [ES] cresce al crescere di [ S ]. L'inibitore incompetitívo è inibitore per il suo effetto sulla Vmax, ma è virtualmente un attivatore per quanto riguarda la Km.