Trasduzione del Segnale

Presentazione sul tema: "Trasduzione del Segnale"— Transcript della presentazione:

1 Trasduzione del Segnale
Aspetti generali della Trasduzione del Segnale Concetti chiave Specificità Amplificazione Integrazione Interruttori ‘On-Off’ Feedforward e Feedback

2 Gli organismi multicellulari e in particolare i neuroni del sistema nervoso hanno GROSSI problemi di comunicazione Hei tu – I tuoi outputs sono troppo deboli!!! Oi! Abbiamo bisogno di inputs! ? Per piacere, vuoi smettere di inviare segnali? Avanti N. 7, adesso devi spegnerti!

3 I Problemi del Signalling
Le cellule in generale, e i neuroni in particolare, sono esposti a una moltitudine di segnali inclusi quelli provenienti da altre cellule (p.es. segnali derivati da lipidi, piccole molecole organiche o peptidi) così come stimoli ambientali (p.es. luce, calore o variazioni dell’osmolarità) Selezionare i segnali rilevanti da quelli irrilevanti Captare segnali di bassa intensità Tradurre segnali diversi in un comune ‘linguaggio’ intracellulare

4 Le soluzioni Selezionare i segnali rilevanti da quelli irrilevanti
Recettori con un alto grado di specificità Captare segnali di bassa intensità (ad es. a basse concentrazioni) Recettori ad alta affinità accoppiati ad un sistema di amplificazione Tradurre segnali diversi in un comune ‘linguaggio’ intracellulare Attivazione di vie di signalling disegnate attorno a un limitato numero di processi comuni

5 Le cellule rispondono ai segnali in una varietà di modi
Cosa fanno I segnali Le cellule rispondono ai segnali in una varietà di modi Alterazione del metabolismo p.es. Alterazione del metabolismo del glicogeno in risposta all’insulina Eccitamento p.es. propagazione dell’impulso nervoso in risposta a neurotrasmettitori Crescita e Divisione (mitosi) in risposta a fattori di crescita Morte cellulare programmata causata da specifici fattori di ‘morte’ o dalla rimozione di alcuni fattori essenziali Espressione genica alterata – p.es. Sintesi di nuove proteine di membrana in risposta ad un incremento dell’attività sinaptica (plasticità sinaptica)

6 Far attraversare il segnale
Dominio di legame extracellulare Molti segnalatori (p.es. neurotrasmettitori) non possono attraversare la membrana plasmatica. Le cellule risolvono questo problema utilizzando recettori transmembrana. Questi sono proteine posizionate in membrana con il sito attivo per il ligando* sul lato extracellulare e un dominio intracellulare che si accoppia al passo successivo nella catena di trasduzione del segnale *Ligando – una molecola che si lega ed è riconosciuta da un recettore Membrana plasmatica esterno iinterno Dominio transmembrana Dominio intracellulare – si accoppia al passo successivo (può avere attività enzimatica)

7 Definizione di Recettore
Affinchè una proteina possa essere classificata come recettore (e non una semplice proteina di legame) devono essere soddisfatti diversi criteri Specificità – un recettore deve essere in grado di distinguere tra segnali spesso strettamente correlati Alta affinità – Le molecole segnalatrici sono spesso presenti a basse concentrazioni – I recettori possono spesso captare concentrazioni tra nM e pM Saturabilità – una cellula ha un numero finito di recettori, quindi vi è un limite al numero di molecole di ligando che una cellula può legare Reversibilità – l’associazione ligando-recettore non è covalente – quando la concentrazione del ligando diminuisce il complesso può dissociarsi Accoppiamento – il recettore trasferisce un segnale dal ligando alla cellula É quest’ultima caratteristica, più di ogni altra che contraddistingue un recettore da una proteina di legame

8 Curva di attivazione - Saturazione
k3 k1 k2 (A) Se varia il numero dei recettori presenti si modifica il livello di saturazione della curva (B) Se varia l’affinità del recettore per il messaggero la curva trasla sull’asse delle concentrazioni senza che si modifichi il livello di saturazione.

9 Interruttori di accensione e spegnimento
La maggior parte dei segnali è transitoria e pure la risposta dovrebbe essere transitoria. Se si accende un segnale, c’è anche bisogno di una via per spegnerlo. Per esempio, il mancato spegnimento di un segnale che fa aumentare la [Ca2+] nel citosol è una delle cause che induce la morte cellulare. Di fatto, esistono dei sistemi biochimici in grado di passare rapidamente tra due stati: acceso (on) e spento (off). In molti sistemi di signalling accensione e spegnimento sono operati da proteine G e/o da proteine di fosforilazione/defosforilazione Un cambiamento nello stato di attività di un componente a monte porta ad un cambiamento dell’attività di un componente a valle. Il cambiamento può essere attivante o inibente. Esso è interazione-specifico. (p.es. La fosforilazione del target può aumentarne o diminuirne l’attività)

10 Interruttori On-Off –Proteine G eterotrimeriche
Il ciclo di base di legame del GTP/GDP nele proteine G eterotrimeriche. è lo stesso di quello delle proteine G monomeriche. g Scambio del GDP legato col GTP b a GTP INATTIVA GDP GDP a La subunità a si dissocia da bg GTP ATTIVA Pi La subunità a attiva può interagire con lo step successivo della catena di ì signalling e attivarlo a Attività GTPasica della subunità a GTP  GDP+Pi GDP La subunità a si riassocia a bg

11 Interruttori On-Off – Proteine G monomeriche
Ras (p21ras) è un buon esempio per questo tipo di switch. Ras è una piccola (21 kDa) proteina monomerica che lega il GTP o il GDP e ha un’attività GTPasica intrinseca Il fattore di scambio del nucleotide guanidinico (GEF) interagisce con ras Ciò causa lo scambio del GDP legato con il GTP p21ras ras attivata interagisce con il componente successivo della catena di signalling e lo attiva On GTP GDP p21ras GDP p21ras GTP INATTIVA ATTIVA Pi Ras GTPasi stimolata dall’associazione con la GTPase-activating protein (GAP) Off p21ras GDP L’attività GTPasica intrinseca idrolizza il GTP a GDP e Pi

12 Interruttori On-Off – Proteine di fosforilazione/defosforilazione
Protein Kinasi – trasferiscono un fosfato dall’ATP ad amino acidi specifici Protein Fosfatasi – rimuovono un fosfato da specifici amino acidi O-fosfoserina C O H NH Serina C O NH P O- Kinasi Fosfatasi ATP Un cambiamento nello stato di attività di un componente a monte porta ad un cambiamento dell’attività di un componente a valle. Il cambiamento può essere attivante o inibente. Esso è interazione-specifico. (p.es. La fosforilazione del target può aumentarne o diminuirne l’attività) ADP Pi C O NH P O- C O H NH Serina Fosforilazione Defosforilazione O-fosfoserina

13 Risposte iperboliche e sigmoidi
Una risposta iperbolica insorge ogni qual volta un recettore (o un enzima) presenta un unico sito di binding per il ligando “s” Una risposta sigmoide denota cooperatività e insorge ogni qual volta un recettore (o un enzima) presenta “n” siti di binding per il ligando “s” (n≡coefficiente di Hill è un numero intero >1) Qui km è quel valore di concentrazione del ligando al quale si ha il 50% dell’effetto (km corrisponde alla cost. di Michaelis-Menten delle reazioni enzimatiche quando n=1) Risposta iperbolica Risposta sigmoide Le risposte sigmoidi sono caratteristiche di molte cascate di signaling, e rappresentano ciò che i biologi chiamano una risposta ultrasensibile ad un input.

14 Una doppia fosforilazione come causa di ultrasensibiltà
Le cascate di MAP kinasi spesso ricevono inputs da molecole di signaling presenti in membrana in risposta a stimoli extracellulari. raf Erk2 Mek1 ATP ADP MAP chinasi chinasi Fattore di Crescita chinasi chinasi Come mai sono utilizzate tre kinasi invece di una?

15 % di S-P allo stato-stazionario [kinasi] in multipli di EC50
Un importante aspetto del comportamento allo stato stazionario di un sistema di signaling è la forma della curva stimolo-risposta del sistema. % di S-P allo stato-stazionario [kinasi] in multipli di EC50 Un esempio molto comune di sistemi che mostrano curve stimolo-risposta sigmoidi è rappresentato dagli enzimi cooperativi. Un enzima che mostra sensibilità iperbolica richiede un incremento dello stimolo di input di 81 volte per essere portato dal 10% al 90% di attivazione massima. Al contrario, alcuni enzimi e sistemi di signaling mostrano curve stimolo-risposta sigmoidi, che spesso sono ben approssimate dall’equazione di Hill: y = xnH/(Kd + xnH) I primi incrementi dello stimolo producono piccole risposte, ma una volta che l’enzima incomincia a rispondere, raggiunge velocemente la sua risposta massima. In un numero limitato di casi la risposta è come un interruttore; al di sotto di una certa soglia non c’è risposta, e al di sopra di essa la risposta è massimale. Una cellula potrebbe utilizzare una simile risposta in almeno due modi. Lo stato (attività) di riposo (basale) della cellula potrebbe essere vicino al tratto ascendente della curva stimolo-risposta, cosicché un piccolo aumento dello stimolo in ingresso potrebbe portare a una grande risposta. Oppure lo stato (attività) di riposo (basale) della cellula potrebbe essere molto a sinistra del tratto ascendente, nel qual caso il sistema potrebbe filtrare via piccoli stimoli e tuttavia permettere alla cellula di rispondere in maniera decisa a stimoli di ampiezza e durata sufficientemente elevate. Qui Kd rappresenta la costante di dissociazione (costante di equilibrio della reazione di dissociazione). Kd≈kmnH. VEDI: BIOCHEMICAL CALCULATIONS p. 309. Un sistema ultrasensibile richiede un incremento inferiore ad 81 volte nello stimolo di input per guidarlo dal 10% al 90% di massima attivazione

16 allo stato-stazionario
La cascata delle MAP kinasi esibisce una risposta marcatamente ultrasensibile 90% allo stato-stazionario Attività di Erk2 Erk2=MAPK Mos=MAPKKK 10% [Mos] (nM) La risposta è marcatamente ripida; mentre un enzima con risposta iperbolica richiede un incremento di 81 volte dello stimolo di input per guidarlo dal 10% al 90% di attivazione massima, Erk2 (una MAPK) richiede un aumento di circa 2.5 volte Il grafico mostra la velocità di fosforilazione di Erk2 (PRODOTTO) in funzione della concentrazione di Mos (SUBSTRATO) È possibile dimostrare che la cascata delle MAP kinasi ha la potenzialità di esibire una risposta marcatamente ultrasensibile tipo interruttore. Le risposte di Mek-1 (una MAPKK) e Erk2 (una MAPK) all’aggiunta di Mos ricombinante (una MAPKKK) è stata indagata in un sistema in vitro. Erk2 mostrava una risposta tipo interruttore, equivalente a quella di un enzima cooperativo con un coefficiente di Hill di 4 o 5. Pertanto, c’è qualcosa nel meccanismo a cascata che genera una risposta ad interruttore partendo da stimoli graduali.

17 Schema di una cascata di MAPK
Raf Ser-218 Ser-222 Mek1 (topo) Thr-183 Tyr-185 Erk2 (ratto) L’attivazione delle MAPK dipende dalla fosforilazione di due siti nella MAPK. Anche la completa attivazione di MAPKK richiede la fosforilazione di due siti. Qui si assume che le MAPKKK sono attivate e inattivate da enzimi denominati El e E2. MAPKKK* rappresenta la MAPKKK attivata. MAPKK-P e MAPKK-PP rappresentano MAPKK singolarmente e doppiamente fosforilate, rispettivamente. MAPK-P e MAPK-PP rappresentano MAPK singolarmente e doppiamente fosforilate, rispettivamente. L’attivazione delle MAPK dipende dalla fosforilazione di due siti conservati [Thr-183 e Tyr-185 nella p42 MAPK/Erk2 di ratto]. Anche la completa attivazione di MAPKK richiede la fosforilazione di due siti [Ser-218 e Ser-222 nella Mek-1/MKK1 di topo]. Qui si assume che le MAPKKK sono attivate e inattivate da enzimi denominati El e E2. MAPKKK* rappresenta la MAPKKK attivata. MAPKK-P e MAPKK-PP rappresentano MAPKK singolarmente e doppiamente fosforilate, rispettivamente. MAPK-P e MAPK-PP rappresentano MAPK singolarmente e doppiamente fosforilate, rispettivamente. P'ase rappresenta una fosfatasi.

18 Meccanismi di Trasferimento dell’Informazione
Un cambiamento nello stato di attività di un componente a monte porta ad un cambiamento dell’attività di un componente a valle. Il cambiamento può essere attivante o inibente. Esso è interazione-specifico. (p.es. La fosforilazione del target può aumentarne o diminuirne l’attività)

19 un ruolo chiave per i secondi messaggeri
Tipicamente composti a basso peso molecolare prodotti all’interno della cellula da un enzima stimolato dal legame di un ligando a un recettore Adenilato Ciclasi Fosfolipasi C b In entrambi questi sistemi il legame di un singolo ligando ad un recettore produrrà un gran numero di molecole di secondo messaggero - AMPLIFICAZIONE - un ruolo chiave per i secondi messaggeri Membrana plasmatica PIP2 DAG a GTP PLC Attiva la Protein Kinasi C Attivata dalla subunità a di Gs Induce un aumento del Ca2+ citosolico Attivata da recettori legati a Gq IP3 ATP AMP ciclico 2Pi PIP2 – fosfatidilinositolo difosfato IP3 – inositolo trifosfato DAG - diacilglicerolo Attiva la Protein Kinasi A

20 Amplificazione 1 recettore-ligando 500 Proteine G 500 enzimi
105 2ndi messaggeri 250 canali ionici ioni Una molecola di rodopsina assorbe un fotone Sono attivate 500 molecole di trasducina Sono attivate 500 molecole di fosfodiesterasi Sono idrolizzate 105 molecole di GMPc 250 canali del Na vengono chiusi Viene prevenuto l’ingresso nella cellula di ioni Na per secondo per circa un secondo La membrana dei bastoncelli è iperpolarizzata di 1 mV

21 Meccanismi a feedforward e feedback
A volte, molecole non direttamente coinvolte in una reazione enzimatica possono interagire allostericamente con l’enzima stesso alterando la conformazione dell’enzima e quindi la sua velocità di reazione. Quando sono gli stessi substrato o prodotto dell’enzima ad interagire allostericamente con esso, essi possono mediare interazioni a feedback o a feedforward con la via metabolica in cui è coinvolto l’enzima.

22 Meccanismi a feedforward
In una interazione a feedforward, un elemento a monte del processo influenza (positivamente o negativamente) l’attività di un altro elemento che lo segue.

23 + Esempio di regolazione enzimatica feedforward positiva
La piruvato kinasi è attivata dal F1-6biP + Feedforward in uno schema di reazione lineare. Il metabolita X è trasformato in Y, a sua volta trasformato nel prodotto Z. X stimola l’enzima E2 che catalizza la reazione YZ.

24 Inibizione feedforward a livello del sistema nervoso
L’inibizione di neuroni di proiezione selezionati in un NCD innalza il contrasto tra gli stimoli Connessioni inibitorie feed forward da neuroni afferenti (neuroni del 1o ordine) che inibiscono le cellule di proiezione adiacenti NCD= nucleo dei cordoni dorsali (Goll e Burdack delle vie lemniscali) Inibizione ad opera di un neurone a monte della catena

25 Meccanismi a feedback In una interazione a feedback, il prodotto di una reazione enzimatica influenza l’attività di un altro enzima che lo precede nella via metabolica. (A) Feedback negativo in un semplice schema di reazione lineare. Il metabolita X è trasformato in Y, a sua volta trasformato nel prodotto Z. Z inibisce l’enzima E1 che catalizza la reazione XY. (B) Feedback positivo in un semplice schema di reazione lineare. Il metabolita X è trasformato in Y, a sua volta trasformato nel prodotto Z. Z stimolsa l’enzima E1 che catalizza la reazione XY.

26 Inibizione feedback a livello del sistema nervoso
L’inibizione di neuroni di proiezione selezionati in un NCD innalza il contrasto tra gli stimoli Connessione a feedback neuroni del 2o ordine possono pure inibire le cellule di proiezione circostanti. Qui l’inibizione avviene ad opera di un neurone a valle della catena, Mentre nell’esempio precedente (feedforward negativo) l’inibizione avviene ad opera di un neurone a monte della catena. Inibizione ad opera di un neurone a valle della catena

27 Feedback positivo Problema: come può essere immagazzinata informazione, ad es. nel sistema nervoso, partendo da molecole instabili? Consideriamo ad es. il processo di fosforilazione come un meccanismo di immagazzinamento di informazione. La fosforilazione è un meccanismo comune per attivare/disattivare enzimi. Supponiamo che un bit di informazione sia stato immagazzinato in un neurone in seguito alla fosforilazione di un enzima chiave attivandolo. In assenza di una fosfatasi defosforilante lo stato acceso (“on”) dell’enzima potrebbe durare a lungo.

28 È possibile costruire interruttori molecolari stabili?
In assenza di una fosfatasi defosforilante lo stato acceso (“on”) dell’enzima potrebbe durare a lungo. Difficoltà: In realtà, l’emivita della proteina fosforilata è limitata e quindi anche lo stato “on” dell’enzima. Quesito centrale È possibile costruire interruttori molecolari stabili? Secondo questo articolo è possibile costruire interruttori molecolari in grado di immagazzinare informazione indefinitamente, utilizzando reazioni enzimatiche ben note e in maniera estremamente semplice.

29 Interruttori molecolari bistabili
Reazioni in un interruttore bistabile. L’interruttore è costituito da due proteine: la kinasi-1, che può esistere in uno stato inattivo (K1) o in uno stato attivo (K*1p), e una fosfatasi. La transizione tra gli stati inattivo e attivo è dovuta a una reazione di fosforilazione. La fosforilazione può essere catalizzata dalla kinasi-1 attiva (feedback positivo) o dalla kinasi-2 attivata durante una stimolazione neuronale.

30 Eq. 4 è ottenuta sostituendo l’eq.2 nella 3.
In assenza di attività della Kinasi-2, l’interruttore è descritto da quattro equazioni: Eq. 1 stabilisce che la derivata prima della concentrazione della Kinasi-1 attiva dK*1p/dt, è la differenza tra le velocità di reazione della kinasi e della fosfatasi. Eq. 2 è la legge di conservazione per la kinasi-1, dove T è la somma della kinasi-1 attiva (K*1p) e inattiva (K1). Eq. 3 descrive le reazioni della Eq. 1 in termini di cinetiche di Michaelis-Menten, dove Km1 e Km2 sono le costanti di Michaelis per la kinasi-1 e la fosfatasi, rispettivamente; C1 e C2 sono i numeri di turnover della kinasi-1 e della fosfatasi, rispettivamente, e P è la concentrazione della fosfatasi. Eq. 4 è ottenuta sostituendo l’eq.2 nella 3. Il numero di turnover (kcat) E’ una misura dell’attività catalitica di un enzima La kcat è il massimo numero di molecole di substrato convertite in prodotto per unità di tempo e per molecole di enzima. kcat = Vmax/Et Nel nostro caso Et=K*1P Il numero di turnover (kcat) E’ una misura dell’attività catalitica di un enzima La kcat è una misura diretta della produzione catalitica di prodotto a concentrazioni saturanti di substrato. kcat, il numero di turnover, è il massimo numero di molecole di substrato convertite in prodotto per molecola di enzima e per unità di tempo. Secondo il modello di M-M, kcat = Vmax/Et Valori di kcat variano da meno di 1/sec a molti milioni per sec Nel nostro caso Et=K1p* Michaelis-Menten: v=Vmax·S/(Km+S)

31 Velocità (moli/l·10-8/s)
Le velocità di reazione della kinasi-1 e della fosfatasi dipendono dalla frazione di kinasi-1 attiva Velocità (M/s) delle reazioni della kinasi-1 (termine di sinistra nell’Eq. 4) e della fosfatasi (termine di destra nell’Eq. 4) in funzione della frazione dei kinasi-1 attiva (K*1p/T). In assenza di kinasi-1 fosforilata, la velocità di reazione della fosfatasi è zero. All’aumentare di K*1p, la velocità di reazione della fosfatasi aumenta fino alla saturazione. La velocità della reazione della kinasi-1 aumenta all’aumentare di K*1p, ma la velocità decresce nuovamente per concentrazioni elevate di K*1p (K1p*/T>0.5) perchè vi è sempre meno proteina non fosforilata da fosforilare. Velocità (moli/l·10-8/s) Fosfatasi Kinasi Prima che K1p/T<0.5 la [k1] (substrato) pur riducendosi è sempre > di K1p. Quando K1p/T>0.5 la [K1] (substrato) diventa < di K1p  K1p ha sempre meno substrato su cui operare  la velocità diminuisce

32 Stati stabili stato instabile
Grafico della derivata di K*1p (Eq. 4) rispetto al tempo in funzione di K*1p/T. La derivata prima rispetto al tempo della concentrazione di kinasi-1 attiva (dK*pl/dt) è la differenza tra le velocità delle reazioni della kinasi e della fosfatasi. Allo stato stazionario (equilibrio) sara: I punti in corrispondenza di K*1p/T = 0 e di K*1p /T  0.74 rappresentano gli stati stabili. Affinchè uno stato sia stabile, deve essere dK*1p/dt = 0 e d2K*1p/dt2 deve essere negativa. Questa seconda condizione è richiesta affinchè una piccola deviazione da uno stato stabile sia seguita da un ritorno spontaneo a quello stato. In questo esempio i criteri di stabilità sono incontrati in due punti: K*1p/T = 0 e K*1p/T  0.74, mentre K*1p/T  0.22 rappresenta uno stato instabile. Stati stabili C1=30 s-1; C2=3 s-1; Km1 mol=10-6; Km2=2.5x10-9 mol; P=5x10-9 mol; T=5x10-8 molAd esempio: se K*1p /T > 0 ma < 0.22, dK*1p/dt è negativa e K*1p ritornerà velocemente a zero; se K*1p/T > 0.22 ma < 0.74, dK*1p/dt è positiva e K*1p/T aumenterà a 0.74, se K*1p/T diventa > 0.74, dK*1p/dt è negativa e K*1p/T scenderà verso 0.74. stato instabile K*1p/T0.22

33 Affinchè un punto di equilibrio sia stabile, deve essere:
dK*1p/dt = 0 e d2K*1p/dt2 <0 dK*1p/dt d2K*1p/dt2 0.22 0.74 In questo esempio i criteri di stabilità sono incontrati nei due punti: K*1p/T = 0 e K*1p/T  0.74, mentre K*1p/T  0.22 rappresenta un punto di equilibrio instabile

34 stato stabile (fosforil.) stato stabile (defosforil.)
Soluzioni dell’equazione differenziale: per diverse concentrazioni iniziali di K1p* Tempo (s) [K1p*]/T 0.74 0.22 stato stabile (fosforil.) Codici per trovare le soluzioni dell’equazione differenziale dK/dt a diverse condizioni iniziali mediante MATLAB %% Bistability of an autophosphorilation kinase clear; clf; %% Setting some constants: T=total Kinase concentration, P=phosphatase concentration, c1= %% turnover number of kinase, c2=turnover number of phosphatase, K_m1= MM constant for kinase, % K_m2=MM constant for phosphatase % Units: T, P, K_m1, K_m2: M; c1, c2: ; a, b: ..... T=5e-8; P=5.0e-9; c1=30; c2=3; K_m1=1.0e-6; K_m2=2.5e-9; delta_t=0.01; %% Setting some initial values for y=[phosphorilated kinase] and time for j=1:20 y(1)=(j/4)*1.0e-8; t(1)=0; %% Numerical integration 2sing Euler scheme for i=2:10/delta_t t(i)=t(i-1)+delta_t; y(i)= y(i-1) + delta_t * (c1/(K_m1+T-y(i-1))*y(i-1)*(T-y(i-1))-c2/(K_m2+y(i-1))*P*y(i-1)); end %% Plotting results: it will be plotted y normalized to T plot(t,y/T) hold on stato instabile stato stabile (defosforil.) Le curve convergono verso i due punti stabili K*1p/T = 0 e K*1p/T = 0.74 a seconda che la concentrazione iniziale (normalizzata) di K*1p sia rispettivamente minore o maggiore di 0.22, che rappresenta il punto di equilibrio instabile.

35 Stimoli di intensità crescente forniti nel Tempo
L’interruttore può essere acceso permanentemente da uno stimolo esterno Kinasi Fosfatasi Stimolo Funzione neuronale K*1p/T K*2 (nM) Stimoli di intensità crescente forniti nel Tempo Effetto della stimolazione sull’interruttore Stimoli di diversa ampiezza attivano la kinasi-2 in modo graduale. I valori di K*1p mostrati sono le soluzioni allo stato stazionario dell’ Eq. (4) con un termine aggiunto per tener conto dell’attività della kinasi-2 Proprietà della kinasi-2 : Km = 10-6 mol; numero di turnover = 30 s-1. L’attivazione risultante della kinasi-1 è anch’essa graduale finchè la sua attivazione diviene rigenerativa. Da quel momento, l’attività della kinasi-1 rimane alta anche quando lo stimolo verrà rimosso.

36 Meccanismo molecolare del potenziamento a lungo termine
Spina Ramo di un dendrite Assone Terminale presinaptico postsinaptico Sinapsi PSD

37 La “densità postsinaptica o “postsynaptic density” (PSD) è una zona specializzata densa di proteine attaccate al lato citosolico della membrana postsinaptica. La PSD, caratteristica delle sinapsi eccitatorie del SNC, consiste di recettori ionotropici, proteine di sostegno e del citoscheletro, e molecole di signaling. Tali proteine creano un microdominio di signaling, che traduce inputs presinaptici in risposte postsinaptiche. Due sottotipi di recettori glutamatergici, AMPA ed NMDA, mediano la la trasmissione eccitatoria rapida.

38 Trasmissione Sinaptica
Potenziamento Glutamato Potenziale d’azione Glutamato Potenziale d’azione NMDAR AMPAR NMDAR NMDAR AMPAR AMPAR Mg++ Mg++ Na+ Na+ Ca++ I recettori AMPA forniscono la depolarizzazione della membrana postsinaptica, che a sua volta aiuta l’apertura dei recettori NMDA a generare l’ingresso di Ca2+ che può innescare cascate di signaling.

39 Long-term potentiation (LTP): un aumento della forza sinaptica
Il potenziamento a lungo termine o LTP è una forma sinapsi-specifica di plasticità che potrebbe essere correlata ad alcuni tipi di memoria. Protocollo di LTP che induce un ingresso postsinaptico di Ca2+ Corrente postsimnaptica Tempo (min) 60 Bliss & Lomo J Physiol, 1973

40 Long-term potentiation (LTP): un aumento della forza sinaptica
Protocollo di LTP che induce un ingresso postsinaptico di Ca2+ con un inibitore della CaMKII non c’è LTP Corrente postsimnaptica Tempo (min) 60 Lledo et al PNAS 1995, Giese et al Science 1998

41 *CaMKII a bassa attività: Potenziamento precoce (memoria a breve termine?)
Le CaMKII attivate agiscono su proteine preesistenti in attesa di essere attivate. Ad es., fosforilazione di recettori AMPA  risposta postsinaptica più intensa a parità di glutammato liberato fosforilazione Processi di rilascio AMPAR *CaMKII **CaMKII LTP Ca++ NMDAR ** CaMKII ad alta attività: Potenziamento tardivo (memoria a lungo termine?)

42 Premessa La CaMKII è localizzata nella PSD ed è richiesta per l’induzione di LTP La protein kinasi II Ca2+/calmodulina-dipendene (CaMKII) localizzata nella PSD è in una posizione ideale per giocare un ruolo chiave nell’LTP, essendo virtualmente in grado di indurre i processi a valle che potenziano la trasmissione sinaptica. L’ingresso transiente di Ca2+ attraverso canali NMDA, che avviene durante l’induzione dell’LTP, stimola l’autofosforilazione persistente e l’attivazione della CaMKII. L’attivazione persistente della CaMKII suggerisce che essa possa agire come un interruttore bistabile responsabile del rafforzamento tutto-o-nulla delle singole sinapsi. Obiettivo Comprendere il meccanismo di accensione della CaMKII e, in particolare, come la CaMKII possa rimanere in uno stato altamente fosforilato nonostante l’attività delle fosfatasi endogene.

43 Protein Kinasi II Calmodulina-dipendente
La CaMKII è una proteina multimerica in cui l’oloenzima è costituito da 8 a 12 subunità, ciascuna delle quali ha un’attività kinasica. Ciascuna subunità è fosforilabile e il sito di fosforilazione è rappresentato dalla Thr286. La defosforilazione della CaMKII avviene per azione specifica della PP1 trattenuta nella PSD da proteine strutturali. Un oloenzima = 8/12 subunità Un dominio autoinibitorio occupa e blocca il sito catalitico. La Ca2+/calmodulina rimuove il dominio autoinibitorio dal sito catalitico causando fosforilazione e attivazione. Gli oloenzimi di CaMKII formano una struttura ad anello. Negli oloenzimi di CaMKII, le subunità si assemblano in due anelli coplanari, ciascuno contenente 4/6 subunità. In queste strutture ad anello si realizza l’autofosforilazione mediante un processo in cui una subunità fosforila quella accanto. CATALiTICA AUTO- INIBITORIA CaM ASSOCIAZIONE ALLE SUBUNITA’ COOH H2N

44 Meccanismi di bistabilità del sistema CaMKII/PP1 nel PSD
La CaMKII può trovarsi in uno stato attivato (“on”) nel quale la maggior parte delle 8/12 subunità sono fosforilate a livello della Thr286 e in uno stato disattivato (“off”) nel quale esse sono quasi completamente defosforilate. Stato “on” Stato “off” Come fa un gruppo di molecole CaMKII e PP1 nella PSD ad operare come un interruttore che presenta due diversi stati stabili a concentrazioni basali di Ca2+ intracellulare? L’operazione di attivazione è basata su tre reazioni che possono avvenire ai livelli basali di Ca2+

45 Se nessun sito Thr286 in un anello è fosforilato, la prima autofosforilazione richiede il legame di due molecole di Ca2+/calmodulina: una per attivare la subunità catalitica della CaMKII, e l’altra per esporre la Thr286 della subunità adiacente che funge da substrato. Po PoC PoC2 P1C2 C= complesso Ca2+-calmodulina Po=oloenzima non fosforilato P1=oloenz. fosforil. una volta Pertanto, la velocità di autofosforilazione per sito, v1. dipenderà dalla seconda potenza della [Ca2+/calmodulina], che a sua volta dipende dalla quarta potenza della [Ca2+]: KH1 è la [Ca] necessaria affinché il 50% delle molecole di CaMKII possa avere una prima subunità fosforilata (1) v1 = velocità di inizio dell’autofosforilazione per sito (subunità) k1 = costante di velocità dello step di autofosforilazione elementare (reazione n. 4) KH1 = [Ca2+]50 per l’attivazione della CaMKII (0.7 μM, Kuret and Schulman, 1984) [Ca2+]i a riposo (0.1 mM) << KH1  l’inizio procederà lentamente alla [Ca2+] di riposo.

46 (2) Invece, una volta che una o più subunità sono fosforilate, la velocità di fosforilazione della Thr286 diventerà molto più rapida, nonostante la bassa [Ca2+]in, dal momento che è richiesta solo una molecola di Ca2+/calmodulina per esporre la Thr286 della subunità che funge da substrato. P1 P1C P2 Pertanto, la velocità di autofosforilazione per sito, v2, della CaMKII parzialmente fosforilata sarà superiore a v1, in quanto dipenderà solo dalla quarta potenza della [Ca2+]: (2) Dopo che una o più subunità sono state fosforilate e sono diventate Ca2+-indipendenti, una subunità fosforilata può fosforilare la sua vicina, a condizione che la subunità vicina leghi una molecola di Ca2+/calmodulina per renderla un efficiente substrato esponendo la Thr286. Essendo richiesta solo una molecole di Ca2+/calmodulina, questa reazione procederà molto più rapidamente della (1) al livello di riposo della concentrazione intracellulare di. Ca2+. k1 è la costante di velocità della reazione (2). In v2 si assiste a un fenomeno di cooperatività che accelera la reazione di fosforilazione.

47 (3) I siti della Thr286 della CaMKII vengono defosforilati ad opera esclusivamente della PP1 tenuta nella PSD da proteine di sostegno: il contributo delle altre fosfatasi è minimo in quanto non sono in grado di funzionare nella PSD. La defosforilazione delle subunità procede secondo lo schema di Michaelis-Menten: SP = subunità fosforilata S = subunità defosforilata E = fosfatasi (3) Pertanto, la velocità di defosforilazione per sito della CaMKII parzialmente fosforilata, v3, sarà: k2 = costante catalitica (N. di turnover) della PP1 KM = costante di MM ep = concentrazione di PP1 attiva* Pi = concentrazione dell’oloenzima fosforilato i-volte. *Nota: la [PP1] attiva è a sua volta controllata dalla [Ca2+/CaM] K2 è il numero di turnover: K2=Vmax/ep  Vmax=k2·ep Quindi, il compartimento biochimico di rilievo è il volume della PSD all’interno del quale la concentrazione delle subunità della CaMKII è 100–200 μM. Se vi è un numero significativamente elevato di subunità fosforilate della CaMKII, la loro concentrazione sarà molto più alta della KM della fosfatasi (1 μM), e vi sarà saturazione della fosfatasi.

48 Interpretazione intuitiva di come questo sistema chimico può operare da interruttore
Quando gli oloenzimi CaMKII sono pochissimo fosforilati, la velocità alla quale i siti disponibili diventano autofosforilati è bassa perchè la reazione (1) è lenta. Al contrario, la PP1 può rapidamente defosforilare ogni sito fosforilato poichè essa non è saturata (vi sono pochi siti sui quali la PP1 deve intervenire). Lo stato “off” è pertanto stabile (e quindi favorito) poichè la velocità di autofosforilazione della CaMKII per sito è bassa rispetto alla velocità della fosfatasi per sito. Questa situazione è ribaltata nello stato “on”. In questo caso, la reazione della CaMKII è più veloce (essendo richiesta solo una calmodulina per la reazione (2). D’altro canto, l’alta concentrazione di subunità fosforilate satura la fosfatasi, e la velocità alla quale essa può defosforilare le varie subunità è pertanto bassa. Lo stato “on” è quindi stabile (e quindi favorito) essendo la velocità di autofosforilazione della CaMKII per sito alta rispetto alla velocità della fosfatasi per sito.

49 SIMULAZIONE

50 stato stabile (fosforil.) stato stabile (defosforil.)
Tempo (s) [K1p*]/T 0.74 0.22 stato stabile (fosforil.) stato instabile stato stabile (defosforil.)

51 La simulazione mette in evidenza l’esistenza di un sistema bistabile a [Ca2+]in basali che dipende dalle proprietà della fosfatasi presente nella PSD Allo stato stazionario, il livello di fosforilazione delle Thr286 varia con la concentrazione intracellulare di Ca2+. Vi sono due livelli stabili (punti neri) di fosforilazione a [Ca2+]in basali (linea verticale). Il sistema è bistabile in un ampio intervallo di [Ca2+]in (area ombreggiata). Il punto rosso indica la percentuale totale di siti di Thr286 fosforilati dopo che il 20% dell’oloenzima della CaMKII nello stato “on” altamente fosforilato è stato rimpiazzato da oloenzimi non fosforilati. Tale perturbazione non è sufficiente a spingere il sistema nello stato “off”. Il passaggio del sistema allo stato “off” richiederebbe che la fosforilazione precipitasse al di sotto del livello marcato con il punto giallo (punto di equilibrio instabile). Parametri usati nella simulazione: K1= 0.5 s-1, KH1= 1.7 microM, [CaMKII] = 20 microM, K2 = 2 s-1, ep0 = 1 microM, KM = 0.4 microM, KH2 = 0.7 microM, I0 = 0.1 microM, VCaN = 1 microM s-1, VPKA = 1 microM s-1. NOTA BENE: La CaMKII nella PSD può essere defosforilata solo dalla PP1.

52 Un aumento della [Ca2+]in aumenta la frequenza di autofosforilazione.
Se la [Ca2+]in è quella basale (bassa), il grado di fosforilazione allo stato stazionario della CaMKII è basso (cerchio nero nel grafico). Successivamente, un ingresso di Ca2+, causato ad es. da stimolazione elettrica, può muovere transitoriamente la [Ca2+]in verso destra, a valori molto più elevati.

53 Un aumento della [Ca2+] aumenta la frequenza di autofosforilazione.
Se la [Ca2+]in rimane per un certo tempo elevata, a destra della regione grigia, l’autofosforilazione farà saltare stabilmente l’attività della CaMKII da un livello basso ad uno alto (cerchio nero nel grafico). Successivamente, quando la [Ca2+]in ritorna a livelli basali, lo stato della CaMKII si riduce, muovendosi verso sinistra. Ma l’attività della CaMKII permane comunque ad un livello alto, con sostenuta autofosforilazione.

54 *CaMKII a bassa attività: Potenziamento precoce (memoria a breve termine?)
Le CaMKII attivate agiscono su proteine preesistenti in attesa di essere attivate. Ad es., fosforilazione di recettori AMPA  risposta postsinaptica più intensa a parità di glutammato liberato fosforilazione Processi di rilascio AMPAR *CaMKII **CaMKII LTP Ca++ NMDAR ** CaMKII ad alta attività: Potenziamento tardivo (memoria a lungo termine?)