Capacitazione in vitro dello spermatozoo e Reazione Acrosomiale

Presentazione sul tema: "Capacitazione in vitro dello spermatozoo e Reazione Acrosomiale"— Transcript della presentazione:

1 Capacitazione in vitro dello spermatozoo e Reazione Acrosomiale
Scuola di Specializzazione in Fisiopatologia della Riproduzione degli Animali Domestici (AA 2016/17) Corso di Biotecnologie della Riproduzione Prof.ssa M.E. Dell’Aquila Capacitazione in vitro dello spermatozoo e Reazione Acrosomiale Albrizio et al. Reproduction 2004

2 Sommario Definizioni Aspetti storici
Fisiologia capacitazione/AR in vivo Procedure in vitro Valutazione efficienza procedure in vitro Uso di seme fresco e congelato

3 Definizioni: Capacitazione
Insieme dei cambiamenti fisiologici reversibili ai quali lo spermatozoo va incontro quando entra in contatto con il tratto genitale femminile: Riorganizzazione proteine di membrana; Metabolismo fosfolipidi di membrana; Riduzione livelli di colesterolo; Iperattivazione

4 Definizioni: Reazione Acrosomiale
Evento esocitotico irreversibile degli enzimi litici contenuti nell’acrosoma

5 Aspetti storici Austin, 1951 Chang, 1951 Iritani and Niwa, 1971
Yanagimachi, 1990

6 Maturazione morfo-funzionale dello spermatozoo
Tratto riproduttivo maschile Maturazione meiotica Maturazione morfologica Acquisizione della motilità Acquisizione antigeni per capacità fecondante Tratto riproduttivo femminile Capacitazione/Reazione Acrosomiale

7 Flesh & Gadella. Biochim Biophys Acta 2000.

8 Flesh & Gadella Biochim Biophys Acta 2000.

9 A N I C Capacitazione = Eparina e = Calmodulina
= Proteina plasma seminale = Fosfolipide colinico

10 Reazione Acrosomiale Fusione membrana plasmatica e acrosomiale esterna
Esocitosi enzimi litici acrosomiali

11 Capacitazione del Seme e Reazione Acrosomiale
Legame reversibile proteine plasma seminale alla membrana dello spz Legame glicosamminoglicani a proteine plasma seminale Liberazione siti fosfolipidi colinici Modificazione configurazione sterica calmodulina Ingresso ioni calcio Attivazione fosfolipasi A Sintesi lisofosfatidilcolina Fusione membrana plasmatica con membrana acrosomiale esterna

12 Flesh & Gadella. Biochim Biophys Acta 2000.

13 Procedure di capacitazione in vitro Separazione della frazione ad alta motilità
Percoll gradient Swim up

14 Flesh & Gadella. Biochim Biophys Acta 2000.

15 Valutazione delle procedure di capacitazione
Staining techniques Microscopia in fluorescenza: CTC-Hoechst, Flow Cytometry Oocyte penetration tests Microscopia elettronica: penetrazione di ZP congelate Sperm-zona binding Microscopia in fluorescenza

16 HOECHST 33258 B A PROTOCOLLO SPERIMENTALE:
COLORANTE SOPRAVITALE FLUORESCENTE NON INTERCALANTE CON SPECIFICITA’ PER ADENINA E TIMINA . EMETTE LUCE DI COLORE CELESTE/BLU A 420 nm SE COLPITO DA LUCE CON LUNGHEZZA D’ONDA nm PERMETTE DI EVIDENZIARE SPERMATOZOI VIVI (A) OPPURE MORTI (B), IN BASE ALL’ INTEGRITA’ DELLA MEMBRANA E QUINDI ALLA CAPACITA’ O MENO DI POTER PENETRARE NELLA CELLULA B A PROTOCOLLO SPERIMENTALE: aggiungere 0.5 ml di soluzione Hoechst (10 mg/ml) a 50 ml di seme derivante dal trattamento con la sostanza da testare incubare per 2’, aggiungere 500 ml di 2% PVP e centrifugare a 900xg per 5’ rimuovere il sovranatante e risospendere il pellet in 45 ml di TALP, quindi procedere con il trattamento con CTC Albrizio et al. Reproduction 2004

17 CHLORTETRACYCLINE (CTC)
E’ UN ANTIBIOTICO IN GRADO DI LEGARSI A REGIONI IDROFOBICHE DELLA MEMBRANA IN MODO CALCIO-DIPENDENTE. EMETTE LUCE DI COLORE VERDE A 470 nm SE COLPITO DA LUCE CON LUNGHEZZA D’ONDA nm PERMETTE DI EVIDENZIARE SPERMATOZOI NORMALI (A), CAPACITATI (B) E CON REAZIONE ACROSOMIALE (C), IN BASE AI DIVERSI PATTERNS CHE SI MANIFESTANO PER I CAMBIAMENTI DELLA MEMBRANA A B C Albrizio et al. Reproduction 2004 PROTOCOLLO SPERIMENTALE: sciogliere g di CTC e g di L-cisteina in una soluzione contenente Tris 20mM, NaCl 130mM a pH=7.8 miscelare 50 ml di spermatozoi derivanti al trattamento con Hoechst con 50ml di soluzione di CTC aggiungere 15 ml di glutaraldeide al 12.5% in Tris 1M pH=7.0 per fissare montare i vetrini mettendo 5 ml della miscela spermatica e osservare entro 1 ora

18 Analisi citofluorimetriche

19 Merocyanine 540/Yo-Pro-1 staining Analisi citofluorimetrica dello stato di capacitazione
Cellule spermatiche in Tyrodes Medium/bicarbonato contenente: 2.7 M di Merocyanine 540 (sensibile alle variazioni fosfolipidiche della membrana) 25nM di Yo-Pro-1 (specifico per gli acidi nucleici relativamente impermeabile alle membrane) 0.5mg/ml PVA 0.5mg/ml PVP Incubare in un bagnetto riscaldato a 37°C per 30 min Analisi citofluorimetrica della capacitazione è condotta con FACS Vantage SE: Merocyanine 540/Yo-Pro-1 sono eccitati da un laser a ioni di Argon ad una =488 nm. La fluorescenza è misurata a  di emissione rispettivamente a 520 e 575 nm. Vengono analizzate spermatozoi al secondo.

20 FITC-PNA/PI staining Analisi citofluorimetrica della reazione acrosomiale Incubare le cellule spermatiche con 5g/ml di FITC-PNA (marker per la reazione acrosomiale) e 1M di PI (marker per le cellule morte). Analisi con FACS scan

21 SYBR 14/PE-PNA/PI staining
Valutazione citofluorimetrica simultanea della vitalità e dell’integrità dell’acrosoma Aggiungere ad 1 ml di seme diluito: 100 nM SYBR-14 (*componente A, diluito 10 volte in DMSO) 2.5 mg/ml PE-PNA (in tampone come Nagy et al., 2003 ) 12 mM PI (*componente B non diluito) * LIVE/DEAD Sperm Viability kit, Molecular Probes, OR, USA Nagy et al., 2003 Biol Reprod 68,

22 Uso di seme fresco e congelato
Le procedure di congelamento incidono sulla vitalità del seme Le procedure di congelamento incidono sullo stato di capacitazione e di reazione acrosomiale degli spermatozoi

23 Letture consigliate Gordon I.“Capacitating bovine sperm” In: “Laboratory production of cattle embryos” CABI Publishing Dublin 2003 II ed., Chapter 5. Flesh FM & Gadella BM. Dynamics of the mammalian plasma membrane in the process of fertilization. Biochim Biophys Acta 2000; 1469: Rathi et al.,2001. Evaluation of in vitro capacitation of stallion spermatozoa. Biol Reprod 65: Nagy et al., A triple stain flow cytometric method to assess plasma- and acrosome-membrane integrity of cryopreserved bovine sperm … Biol Reprod 68: