Ricerca di nuovi organismi produttori (campionamento)

Presentazione sul tema: "Ricerca di nuovi organismi produttori (campionamento)"— Transcript della presentazione:

1 Ricerca di nuovi organismi produttori (campionamento)
Ricerca di mutanti naturali (campionamento o mutanti spontanei) Mutagenesi indotta (screening o selezione) Ingegneria genetica (selezione) In mezzo secolo la produzione è passata dalle 2 unità/ml alle unità/ml. Il ceppo originario isolato da Fleming nel 1929 era il Penicillium notatum. I ceppi produttori attuali sono derivati dal Penicillium chrysogenum, isolato da un melone in putrefazione nel 1951. Penicillum notatum

2 Aspetti genetici dell'ottimizzazione biosintetica
Mutazione classica e selezione > migliori produttori Tecniche moderne (purificazioni enzimatiche, sequenziamento, ibridazione interspecifica DNA/DNA, espressione funzionale) > isolamento dei geni biosintetici: Aminoadipil cisteinil valina sintetasi Isopenicillina N sintasi AcilCoA isopenicillina N aciltransferasi Efficacia dei metodi di miglioramento: il grosso fatto con metodi classici. Le tecniche di DNA ricombinante hanno permesso di studiare i riarrangiamenti genetici nei ceppi produttori di 50 anni di applicazione dei metodi classici e studiare i colli di bottiglia e la regolazione delle vie biosintetiche.

3 Mutazione indotta nel produttore (es nitroso-metil guanidina, UV etc) Selezione del miglior produttore Miglioramenti di questo procedimento per ovviare ad inconvenienti dovuti alla variabilità delle misure dei parametri biologici (es. il titolo di produzione) e al numero di cloni da analizzare. Esempio: selezione su piastra del migliore produttore (test degli aloni di inibizione) ma anche di cloni con caratteristiche associate alla produzione.

4 Resistenza ad antimetaboliti > maggiore produzione degli aminoacidi precursori
Reversione di mutanti auxotrofici > produzione deregolata dei precursori (valina e, in certi organismi, lisina) Resistenza ad antibiotici polienici > alterazione permeabilità della membrana, maggiore secrezione Resistenza a metalli pesanti tossici > complessati e neutralizzati dalla penicillina Resistenza ai precursori della catena laterale (acido fenilacetico e fenossiacetico) Caratteristiche morfologiche: la crescita come pellet invece che filamentosa migliora le caratteristiche della coltura, es. resistenza all'agitazione (energia, temperatura) e separazione dal terreno Mutanti derepressi per la repressione da catabolita (es glucosio) o mutanti con rese (g penicillina/g glucosio) più elevate > abbassamento dei costi del terreno. Attualmente nei migliori produttori la conversione è del 20% di glucosio consumato in penicillina

5 Alterazioni a livello di struttura ed espressione genica nei ceppi produttori
Prima osservazione: nei migliori produttori si è osservato un incremento (fino a 50 volte) del dosaggio dei geni strutturali (amplificazione del cluster genico e delle sequenze fiancheggianti: l'amplicone) Meccanismo di amplificazione proposto: Allineamento e ricombinazione non omologa tra le sequenze fiancheggianti (identificato l' hot spot (TTTACA) di ricombinazione e sequenze fiancheggianti ricombinogeniche: la delezione di questi elementi porta a ceppi non amplificabili) Duplicazione del cluster Amplificazione per successive ricombinazioni omologhe Meccanismi di regolazione: nei migliori produttori, oltre all'amplificazione, si è osservato anche un aumento del livello del messaggero per copia genica Alterazione del promotore? Alterazione del regolatore? (nessun regolatore specifico identificato finora)

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7 Ricerca del passaggio limitante in A. nidulans:
1. Clonaggio dei geni strutturali con il controllo del promotore di ADH1 (forte ed inducibile) 2. Integrazione dei costrutti in singola copia 3. Induzione dell’espressione del gene e misura del prodotto • Sovraespressione di ACVS > 30 volte di incremento del prodotto • Sovrespressione di IPNS e/o AAT > produzione uguale o ridotta Il passaggio limitante è la sintesi di ACV In P. chrysogenum un passaggio limitante potrebbe essere la sintesi di fenilacetil-CoA da parte della ligasi PCL: • PCL da Pseudomonas putida con promotore di pcbAB • Trasformazione di P. chrysogenum • Incremento di 2 volte della produzione Incremento di produzione in P. chrysogenum con extracopie dei geni strutturali introdotti ad hoc o usando promotori forti (es. quello costitutivo di pgkA o quello inducible di XylP): per ora non ci sono evidenze dimostrate e pubblicate

8 Prevenzione dell’ ossidazione dei preCursori della catena laterale
Il precursore rappresenta un costo significativo nella composizione del terreno Il precursore può essere metabolizzato dal produttore riducendo la resa in prodotto o producendo penicilline non desiderate (alterazione del precursore) Il metabolismo di fenilacetato (PA) è stato studiato in A. nidulans, che usa PA come unica fonte di C. Il primo enzima della via è la PA idrossilasi (phacA). L’inattivazione di phacA aumenta la resa in prodotto e diminuisce la necessità di PA nel terreno Probabilmente alcuni mutanti classici migliori produttori di P. chrysogenum hanno phacA inattivata. Finora, comunque, in P. chrysogenum non è stata ancora dimostrata e riportata alcuna distruzione genica specifica e mirata. P. chrysogenum usa PA meno bene di A. nidulans come fonte di C: è uno dei motivi per cui è un migliore produttore di penicillina G?

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10 Geni regolativi Mutazioni regolative > aumento dell’espressione dei geni strutturali. Campo di ricerca ancora aperto: solo per la dipendenza dal pH è stato caratterizzato un gene regolativo Repressione da catabolita. In A. nidulans la repressione da glucosio della biosintesi di penicillina ha un meccanismo indipendente da creA (il principale gene regolativo del metabolismo primario. Neppure areA, il regolatore della repressione da azoto (ammonio), sembra avere un effetto sulla biosintesi della penicillina Al contrario, in P. chrysogenum, NRE (l’equivalente di AreA) si lega ai promotori di pcbAB e pcbC, ma non si hanno ulteriori dati sulla sua funzione regolativa (es. effetti di mutazioni nre) In A. nidulans, la produzione è stimolata da pH alcalino ed il regolatore è PacC (proteina Zinc-finger) che attiva l’espressione di ipnA tramite il legame con i siti GCCARG del promotore (figura 3). Mutazioni pacCc (costitutive) incrementano la produzione mimando una situazione di pH alcalino e inducendo anche la trascrizione di acvA e acyA. Viceversa, mutazioni pal- (vedi figura 3) riducono la produzione. Anche in P. chrysogenum la produzione e’ stimolata a pH alcalino ed esiste l’omologo di pacC. Il sistema è in fase di studio

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12 Identificazione di altri fattori regolativi:
>DNA-binding con estratti proteici e DNA del promotore > isolamento e microsequenza dei fattori legati > traduzione inversa e identificazione dei geni > inattivazione dei geni corrispondenti (reverse genetics: trovato così in A. nidulans il regolatore PENR1) Identificazione di altri fattori di A. nidulans (PrgA1, PrgB1 e NpeE1) con: > fusioni dei promotori con geni reporter (es LacZ) > mutagenesi per perdita di attività > complementazione

13 Oltre ai tre geni strutturali, altri aspetti produttivi non sono da trascurare:
La via biosintetica della lisina fornisce il precursore -aminoadipato (vedi figura). Ancora non si sa se l’approvvigionamento del precursore può avere un effetto sulla resa produttiva della penicillina Poco si sa sulla secrezione della penicillina. L’enzima AAT (passaggio finale) è associato ad organelli legati a membrane. I passaggi della biosintesi sono quindi compartimentati e mutanti di AAT, che non si associa agli organelli, hanno produzioni limitate

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