CREAZIONE DI ANIMALI TRANSGENICI

Presentazione sul tema: "CREAZIONE DI ANIMALI TRANSGENICI"— Transcript della presentazione:

1 CREAZIONE DI ANIMALI TRANSGENICI
1) Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile di una cellula uovo appena fecondata. Se l’inserimento genico riesce, tutto l’animale che ne deriva è trangenico (comprese cellule germinali) 2) Trasferimento nucleare di cellula somatica con transgene in oocita fecondato privo di nucleo e reimpianto in madre surrogata. Tutto l’animale che ne deriva è trangenico 3)Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in blastocisti di madre surrogata L’animale che ne deriva è chimerico (produrrà transgenici solo se le sue cellule germinali contengono il transgene) A monte del gene da esprimere sempre inserito un promotore, a volte con specificità tissutali

2 Tecnologia del trasferimento nucleare
Clonazione animale: la creazione di Dolly

3 Tecnologia del trasferimento nucleare
Riprogrammazione del nucleo che ripercorrerà l’intero sviluppo

4 Tecnologia del trasferimento nucleare
Dolly, primo esperimento riuscito di clonazione animale (1997) Problematiche della clonazione animale: Alta inefficienza dei metodi di trasferimento nucleare - Alta frequenza di malattie congenite negli animali Invecchiamento prematuro degli animali Considerazioni etiche del pharming soprattutto nelle piante (OGM).

5 Problematiche della clonazione animale
Differenze dovute a fattori epigenetici e ambientali: colore del mantello, personalità. Studi con microarray di espressione su tessuti di animali e loro cloni: centinaia di geni con espressione anormale. La riprogrammazione del nucleo determina alta non vitalità dei cloni o forte alterazione dell’espressione genica

6 TRANSGENESI IN M. musculus
Creazione di animali geneticamente modificati per: conferma di gene candidato responsabile di una patologia umana - studio della funzione e della regolazione di un gene modelli animali per lo studio delle malattie umane modelli animali sperimentali: per la correzione del difetto genetico (“rescue” fenotipico), per messa a punto terapia farmacologica Un organismo si considera transgenico quando il gene esogeno è: • integrato nel suo genoma; • espresso correttamente e selettivamente in uno o più tessuti dell'animale; • integrato nella linea germinale e quindi trasmissibile dall’animale fondatore alla progenie.

7 TRANSGENESI IN M. musculus
METODI DI TRASFERIMENTO GENICO 1) Trasferimento genico diretto: trasfezione DNA libero con microiniezione 2) Trasferimento tramite vettori: infezione virale (adenovirus, virus adeno-associati, retrovirus) 3) Metodi: Microiniezione nel pronucleo maschile in oocita fecondato - Trasferimento nucleare di cellula con transgene in oocita fecondato privo di nucleo e reimpianto in madre surrogata. - Trasferimento genico in cellule Embrionali Staminali (ES) e reimpianto in blastocisti 4) Tipi di inserzione: - ectopica (influenza di elementi di regolazione endogeni, influenza struttura cromatina) mirata (inserimento in una posizione occupata da sequenza omologa) 5) Possibile controllo dell’espressione genica: geni inseriti a valle di promotori inducibili o tessuto-specifici

8 TRANSGENESI IN M. musculus
KNOCK IN Introduzione di sequenza genica (può appartenere alla stessa specie o può derivare da specie differenti) da esprimere nel topo. Aumento del numero di copie gene endogeno studio della sovraespressione Inserimento di un intero gene esogeno o solo di alcuni esoni può contemporaneamente determinare l’inattivazione del gene endogeno KNOCK OUT Introduzione di sequenza genica per l’abolizione della funzione genica endogena Inattivazione genica costitutiva Inattivazione genica condizionale ESPRESSIONE INDUCIBILE DI UN TRANSGENE Attivazione o inattivazione genica: mutante condizionale

9 Topo knock-in: trasferimento genico per aumentare espressione di un gene endogeno o esprimere un gene esogeno Inserzione ectopica (accoppiata con maschio vasectomizzato)

10 Produzione di organismo knock-in o knock-out per
ricombinazione omologa con gene endogeno DNA esogeno Inserzione mirata DNA genomico

11 Produzione di organismo knock-out per
ricombinazione omologa con gene endogeno

12 Produzione di organismo Knock-out per
ricombinazione omologa con gene endogeno Inserzione mirata

13 Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in blastocisti
Le cellule staminali embrionali derivano dalla massa di cellule interne della blastocisti, 3,5 - 4,5 giorni dopo l’accoppiamento. Possono essere mantenute in coltura con fattori che impediscono il differenziamento: totipotenti Cellule staminali pluripotenti isolate anche da feto e adulto (numero e capacità differenziative limitati)

14 Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in blastocisti
Il topo è una chimera Zigote Mutazione genetica in due popolazioni cellulari Mosaico una delle cellule differiscono per una mutazione Zigote 1 (blastocisti) due popolazioni cellulari Chimera Zigote 2 (cellula ES transgenica) con genotipo diverso

15 Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in blastocisti
Solo alcuni topi avranno cellule germinali transgeniche e produrranno gameti da cui deriveranno topi transgenici

16 Mutagenesi di ES con inserzione mirata per produzione topo KO
Si controlla il corretto inserimento attraverso la metodica della selezione positiva-negativa con G418 e ganciclovir Vettore con: Gene tk (timidino-chinasi) (tk+) dell’Herpes virus (tk HSV), Gene della Neomicina resistenza = neoR all’interno di un esone del gene da inattivare Gene endogeno nelle cellule ES inattivato per inserzione mirata del gene neoR Tk = pathway di recupero dei nucleotidi: converte la timidina libera in monofosfato per la sintesi DNA

17 Selezione positiva-negativa con G418 e ganciclovir
G418: analogo della neomicina Ganciclovir (Gcv) è un analogo del nucleoside erpetico: uccide le cellule tk+, ovvero con inserzione ectopica del vettore virale Gcv Gcv-P Gcv-PPP Incorporazione DNA Terminazione catena con rottura del DNA Tk HSV Tk mammifero

18 Selezione positiva-negativa con G418 e ganciclovir
Cellule ES con mutazione impiantate in blastociti di madre surrogata

19 Mutagenesi di ES con inserzione mirata per produzione topo ko
Cellule ES con mutazione impiantate in blastociti di madre surrogata

20 Produzione di topo ko (in omozigosi) successiva a inserzione mirata in
un gene endogeno I topi interamente neri (a/a M/M) sono esclusi Aguti Fenotipo ko = Coda arricciata Genotipizzazione

21 CREAZIONE TOPO KnockOut
Microiniezione di vettore ricombinante in nucleo cellule ES di topo marrone Selezione con G418 e gancyclovir di ES che hanno avuto ricombinazione omologa e inattivazione del gene 3) Inserimento delle cellule ES transgeniche in una blastocisti di topo mantello nero e impianto in una madre pseudogravida (mantello nero) 4) Selezione progenie chimerica 5) Individuazione genotipi eterozigoti 6) Incrocio di eterozigoti per ottenere topo omozigote knock-out

22 Topi transgenici Topo nero: apparentemente
nessun contributo di cellule ES Topo fondatore chimerico: forte contributo delle cellule ES Topo fondatore chimerico: debole contributo delle cellule ES

23 TRANSGENESI IN M. musculus
Controllo di espressione del transgene Uso di promotori costitutivi (es: promotore + enhancer di SV40, sequenze riconosciute in diversi tipi cellulari) per ottenere geni sempre attivi e molto espressi Uso di promotori inducibili specifici per tipo cellulare o stadio di sviluppo Uso di proteine di fusione rilevabili facilmente (es: gene fuso con cDNA proteina GFP). Gene da esprimere fuso con peptidi target di anticorpi fluorescenti.

24 Ereditato come Autosomico Dominante
Terapia genica della linea germinale: esempio di applicazione nel topo nano (little, lit/lit) Promotore MP di topo attivato da alte concentrazioni di zinco e cadmio nella dieta Topo nano Uovo fecondato di topolina nana Dieta con cadmio e zinco È il doppio del nano Ereditato come Autosomico Dominante

25 Studio dell’espressione genica di Evc murino
Produzione di organismo Knock-in per ricombinazione e inserzione di un transgene (gene reporter) sotto controllo trascrizionale di un gene endogeno Inserzione del gene LacZ sotto controllo trascrizionale degli elementi regolativi del gene Evc (proteina coinvolta nella crescita e sviluppo di cartilagini e denti). SI STUDIANO DUE ASPETTI: - CONSEGUENZE INATTIVAZIONE - NORMALE PATTERN DI ESPRESSIONE TISSUTALE Sindrome Ellis van Creveld (AR): acondroplasia associata con alterazioni dello sviluppo della cute, dei capelli e dei denti, polidattilia e con difetti del setto cardiaco Embrione Evc +/- Forte espressione nelle regioni della bocca Creazione omozigoti Evc -/-

26 Produzione di topo knock out ed analisi fenotipica
Arti corti e anomalie scheletriche osso cartilagine Anomalie nella dentizione

27 I topi sono sempre un buon modello?
Differenze nelle vie biochimiche Differenze nei percorsi di sviluppo Durata della vita media (esordio tardivo nell’uomo) Differenze nel contesto genetico

28 ESEMPI DI MODELLI MURINI DI PATOLOGIE UMANE OTTENUTI CON METODI TRANSGENETICI
Malattia Gene Metodo Fibrosi cistica CFTR Inattivazione da inserzione mirata Beta talassemia Beta globina Malattia di Gaucher GBA Sindrome dell’X fragile FMR1 Sindrome da prioni umana PRNP Integrazione del gene murino mutante della proteina prionica Atassia spinocerebellare I SCA1 (atassina) Integrazione del gene umano espanso

29 I topi sono sempre un buon modello?
Mutazioni spontanee in topi, patologie spesso diverse dalle umane Topo NOD: diabetico ma senza obesità. Assomiglia al diabete insulino-dipendente umano Topo mdx: mutazione nonsenso nel gene mdx, distrofia molto più lieve della DMD Modelli per malattie con perdita di funzione: identificazione ortologo e creazione topo knock-out. Produzione di: alleli nulli (assenza completa di funzione), mutazioni leaky, (inattivazione geni con funzione simile) Differenza nel fenotipo possibile per presenza di geni modificatori in differenti ceppi murini Modelli per malattie umane con acquisto di funzione: topo knock-in (es inserimento di oncogeni, geni con triplette espanse)

30 Efficienza del trasferimento genico
Meno del 5% della prole è transgenica Problematiche: Alta inefficienza dei metodi di trasferimento nucleare o microiniezione nei pronuclei. - Clonazione animale: alta frequenza di malattie congenite negli animali Invecchiamento prematuro degli animali Considerazioni etiche del pharming soprattutto nelle piante (OGM).

31 Animali come organismi modello

32 APPROCCI PRINCIPALI PER STUDIARE IN VIVO LA FUNZIONE GENICA MODIFICANDO GENETICAMENTE EUCARIOTI MODELLO a livello del DNA