Elementi trasponibili nel mais

Presentazione sul tema: "Elementi trasponibili nel mais"— Transcript della presentazione:

1 Elementi trasponibili nel mais
Barbara McClintock negli anni ’50 scoprì nel mais un fattore genetico che chiamò Ds (Dissociation), che causava un’elevata tendenza alle rotture cromosomiche; in particolare aveva inizialmente osservato queste rotture sul cromosoma 9. L’azione di Ds determinava INSTABILITA’ ed i chicchi delle pannocchie apparivano variegati

2 Instabilità cromosomica dovuta all’ elemento Ds nel mais
Nodo Coppia di omologhi del cromosoma 9 durante la mitosi Locus Ds Deleto e perso (osservabile citologicamente) Le cariossidi sono: C -> Colorate Sh -> Lisce Bz -> Gialle Wx -> Amidacee Wx C Bz Fenotipi recessivi che si manifestano in presenza di Ds c sh bz wx Ds C Sh Bz Wx Sh Il tessuto risultante è: c -> colorless (incolore) sh -> shrunken (grinzoso) bz -> bronze (bronzato) wx -> waxi (ceroso)

3 Altre osservazioni di Barbara McClintock
Il manifestarsi dell’instabilità dipendeva dalla presenza di un altro locus , un gene non associato a Ds che chiamò Ac (Activator). Il locus Ds, in assenza di Ac, poteva essere mappato in regioni specifiche del cromosoma (spesso sul cromosoma 9) Mc Clintock scoprì che invece Ac non poteva essere mappato come era stato fino ad allora possibile fare con tutti gli altri loci genetici identificati, perché in linee differenti si presentava in posizioni differenti. Scoprì inoltre che anche il locus Ds cambiava posizione, quando era presente Ac L’elemento Ac è stato definito dalla McClintock un elemento AUTONOMO, mentre Ds è stato definito elemento NON AUTONOMO

4 Fenotipi osservati in cariossidi di mais con particolari genotipi
C -> Colorato c -> incolore CDs/CDs; Ac+/Ac+ X cDs+/cDs+; Ac/Ac F1: CDs/cDs+; Ac+/Ac completamente pigmentate CDs/cDs+; Ac/Ac+ con chiazze senza colore va perso in ALCUNE CELLULE (si manifesta il recessivo) 1 cariosside C*Ds/cDs+; Ac/Ac+ Incolore, instabile ? Ac+ e Ds+ indicano ASSENZA dell’elemento

5 Spiegazione dei fenotipi osservati
In questa cariosside c’e il fenotipo pigmentato con alcune chiazze bianche, ciò significa che in quelle cellule in cui manca la pigmentazione si è avuta una rottura cromosomica in corrispondenza del locus C (Colored) che quindi permette l’espressione del recessivo c (senza colore). Una chiazza piccola indica che la rottura è avvenuta in una fase tardiva dello sviluppo del chicco della pannochia, mentre una chiazza più grande indica che la rottura è avvenuta precocemente. Nelle prime fasi dello sviluppo di questa pannocchia si è espresso il carattere recessivo c (senza colore); la presenza di chiazze pigmentate dimostra che il processo è REVERSIBILE in quanto consente nuovamente l’espressione di C. Non può quindi trattarsi di una rottura cromosomica che non tornerebbe mai indietro. Quello che accade realmente è che l’elemento Ds si inserisce nel gene C disattivandolo senza indurre rottura cromosomica; in seguito Ds si ESCINDE e RIPRISTINA la funzione di C (anche questo secondo tipo di fenomeno richiede la presenza dell’elemento Ac.

6 Mosaicismo nel mais dovuto ad elementi trasponibili
Chiazze grandi Chiazze piccole Chiazze intermedie

7 Possibili conseguenze della presenza degli elementi Ac e Ds
- Gene 1- - Gene 2- Ds manca Ac Allele stabile del gene 1, inattivato da Ds Ds Ac Reversione solo in presenza di Ac Ds Ac Trasposizione nel gene 2 Allele instabile del gene 1, inattivato da Ac Ac Ac Reversione e trasposizione dipendente da Ac

8 Possibili conseguenze della presenza degli elementi Ac e Ds
- Gene 1- - Gene 2- Ds manca Ac Allele stabile del gene 1, inattivato da Ds Ds Ds Ac Reversione solo in presenza di Ac Ds Ac Trasposizione nel gene 2 Allele instabile del gene 1, inattivato da Ac Ac Ac Reversione e trasposizione dipendente da Ac

9 Possibili conseguenze della presenza degli elementi Ac e Ds
- Gene 1- - Gene 2- Ds manca Ac Allele stabile del gene 1, inattivato da Ds Ds Ds Ac Reversione solo in presenza di Ac Ds Ac Trasposizione nel gene 2 Allele instabile del gene 1, inattivato da Ac Ac Ac Reversione e trasposizione dipendente da Ac

10 Conclusioni di Barbara McClintock
Ds determina il suo effetto genetico lì dove è localizzato: può determinare ROTTURE CROMOSOMICHE può rendere NON FUNZIONALE il gene in cui si inserisce Ds si può anche disinserire e quindi è possibile che il gene che era stato inattivato, si RIATTIVI Anche Ac può determinare gli stessi effetti Ac e Ds sono ELEMENTI TRASPONIBILI DI CONTROLLO

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12 Barbara McClintock alla conferenza per il Premio Nobel
Barbara McClintock e le sue pannocchie di mais Barbara McClintock alla conferenza per il Premio Nobel 8 Dicembre 1983

13 Caratterizzazione molecolare degli elementi Ac e Ds
Ac e Ds sono loci genetici trasponibili che possono muoversi nel genoma e presentano alle loro estremità delle sequenze ripetute e invertite. I due elementi sono costituiti da sequenze simili tra loro ma Ds può avere dimensioni diverse da Ac ma più piccole. L’elemento Ac è un elemento completo la cui sequenza compresa tra le due ripetizioni codifica per un enzima che è necessario per la trasposizione : la trasposasi. L’elemento Ac si muove autonomamente, Ds invece è un locus Ac che manca di alcune sequenze nella parte centrale dell’elemento e quindi non produce la trasposasi, ma può muoversi perché le sue “estremità “ (IR) sono intatte Quando c’è Ac che produce la trasposasi Ds si muove andando a interrompere delle sequenze codificanti e determinando l’inattivazione di un gene.

14 Struttura degli elementi Ac e Ds
IR Esone 1 I Esone 2 E4 Esone 5 Esone 3 TRASPOSASI Elemento Ac (Activator) 5’ 3’ TRASCRIZIONE E3 Elementi Ds (Dissociator) IR Esone 1 I Esone 2 E4 Esone 5 Ds9 E2 Esone 3 Ds2d1 Ds2d2 E 1 Ds6 L’elemento Ds deriva dall’elemento Ac; mostra delezioni nelle sequenze codificanti per la TRASPOSASI ed è questo il motivo per cui non è AUTONOMO. Se nello stesso genoma è presente Ac che fornisce la TRASPOSASI, avendo le IR intatte Ds si può muovere

15 Elementi genetici mobili nei BATTERI
Nel 1970, 3 ricercatori (Saedler, Starlinger e Shapiro) studiavano particolari mutazioni nell’operone del galattosio di E.coli : le “mutazioni polari” 3 geni sono coinvolti nel metabolismo del galattosio: Direzione di trascrizione mRNA policistronico operone GAL P E T G (promotore) (epimerasi) (transferasi) (galattochinasi) Alcuni mutanti identificati nell’attività della galattochinasi (ultimo gene) mappavano in diversi punti nell’operone SONO STATE DEFINITE “MUTAZIONI POLARI” Mutazioni non senso in geni “a monte” hanno effetto sui geni “a valle”

16 Particolarità di queste mutazioni
revertivano al tipo selvatico e quindi non si trattava di delezioni, ma le reversioni non erano affatto influenzate da mutageni chimici! non erano mutazioni puntiformi ( né sostituzioni di basi, né frame-shift) Di che tipo di mutazioni si trattava? Alla fine degli anni ‘70 alcuni esperimenti dimostrarono che si trattava di inserzioni di segmenti di DNA che furono chiamati IS (sequenze di inserzione)

17 Il DNA del mutante era più DENSO
Le mutazioni polari nel locus gal sono dovute all’inserzione di elementi IS L’operone del galattosio proveniente sia da batteri gal+ che da batteri gal- è stato inserito in fago  Il sito di inserimento del fago è molto vicino all’operone gal virus  gal+ virus gal- Centrifugazione in gradiente di densità  gal+  gal- DNA virale + elemento inserito Il DNA del mutante era più DENSO

18 Ibridazione del DNA dei due fagi, il normale ed il mutato
Fotografia al microscopio elettronico delle due molecole ibridate di DNA dei fagi  gal+ e  gal -, la stima della grandezza del frammento è stata di 800 bp I segmenti di DNA che si inseriscono sono PEZZI casuali o ENTITA’ GENETICHE distinte?

19 Dimostrazione che si trattava di ENTITA’ GENETICHE SPECIFICHE
Le sequenze furono isolate da mutanti polari ed il loro DNA venne usato per produrre RNA “marcato” Queste sonde ibridavano con il DNA dell’operone del galattosio del ceppo di E. coli mutante, ma non con il DNA dell’operone del galattosio del ceppo del normale La stessa ibridazione si aveva ibridazione anche con altri mutanti polari Questa è la dimostrazione che LO STESSO PEZZO DI DNA era inserito in punti diversi ed in ceppi con diverse mutazioni polari-> questi ELEMENTI sono MOBILI e possono trasporsi in tutto il genoma

20 Sequenze di inserzione batteriche
La prima sequenza identificata di 800 bp fu chiamata IS1 Ad ogni estremità delle IS c’è una ripetizione invertita (IR) perfetta Denominazione dimensioni(bp) ripetuti/invertiti(bp) ripetizioni numero di di sequenza copie nel nel sito di genoma di integrazione E. coli IS / IS / IS IS /

21 Scoperta dei trasposoni
Nel 1950 in un ospedale giapponese si notò che alcuni ceppi di Shigella, isolati da pazienti con dissenteria, si dimostrarono resistenti contemporaneamente a molti ANTIBIOTICI (penicillina, tetraciclina, sulfanilammide, streptomicina, cloramfenicolo) Si notò che la resistenza a questi antibiotici era ereditata in un UNICO BLOCCO GENETICO, e poteva essere trasmessa sia ad altre Shigelle che ad altre specie batteriche Il fattore che portava la resistenza è un fattore plasmidico che si replica AUTONOMAMENTE, molto simile al FATTORE F ed è stato chiamato “fattore R” , da resistenza. Il fattore R viene trasferito mediante coniugazione

22 Se un “fattore R” viene denaturato e rinaturato lentamente si forma una struttura particolare chiamata “ struttura a lecca-lecca” TRASPOSONE Geni per la resistenza ai farmaci Struttura a lecca-lecca IS A B C C’ B‘ A’ A’ B’ C’ C B A C B A C’ B’ A’’ Questi elementi che hanno geni per la resistenza agli antibiotici racchiusi tra due sequenze invertite ripetute (IR, che di solito sono delle IS) sono stati chiamati TRASPOSONI

23 Descrizione di alcuni trasposoni batterici
Trasposone Tn9 2638 bp resistenza al cloramfenicolo IS1 IS1 IR IR Trasposone Tn10 9300 bp resistenza alla tetraciclina IS10 IR I trasposoni batterici traspongono come DNA e possono trovarsi all’interno dei genomi batterici, in siti differenti.

24 Primo elenco dei trasposoni batterici
Trasposone marcatore coppie di basi ripetizione invertite Tn1 ampicillina Tn2 ampicillina “ “ Tn3 ampicillina “ “ Tn4 ampicillina,streptomicina corta sulfonammide Tn5 canamicina (IS50) Tn6 canamicina non individuabile al microscopio elettronico Tn7 trimetoprim,streptomicina “ Tn9 cloramfenicolo (IS1) Tn10 tetraciclina (IS10) Tn204 cloramfenicolo,acidofusidico Tn402 trimetoprim non individuabile Tn501 ione mercurio Tn551 eritromicina Tn554 eritromicina,spectrinomicina non determinata Tn732 gentanamicina,tobramicina non determinata Tn903 canamicina Tn917 eritromicina corta Tn951 lac corta Tn1681 enterotossina termostabile (IS1) Tn1721 Tetraciclina corta