Elettroforesi su gel di agarosio

Presentazione sul tema: "Elettroforesi su gel di agarosio"— Transcript della presentazione:

1 Elettroforesi su gel di agarosio
è definita come la migrazione di particelle cariche sotto l’influenza di un campo elettrico viene utilizzata per separare, identificare e purificare frammenti di DNA

2 L’apparecchiatura per l’elettroforesi è composta da un ALIMENTATORE che fornisce una corrente elettrica continua costante e da una CAMERA ELETTROFORETICA che contiene i due elettrodi, positivo (ANODO) e negativo (CATODO). Nella camera elettroforetica viene posto il GEL DI AGAROSIO. La camera elettroforetica viene riempita con la soluzione tampone di corsa (TBE, Tris- Borato EDTA) che permette la conduzione della corrente elettrica.

3 struttura del gel di agarosio
unità ripetitiva di agarosio L’agarosio è un polisaccaride purificato dalle alghe rosse della specie Agar agar. L’agarosio è solubile ad alta temperatura in soluzione acquosa; quando la soluzione si raffredda si forma una matrice (gel) a causa della formazione di legami idrogeno crociati tra le catene polimeriche dell’agarosio. Il GEL DI AGAROSIO è il supporto sul quale avviene l’elettroforesi, e funge anche da setaccio molecolare per separare le molecole di DNA in base alle dimensioni struttura del gel di agarosio

4 Percentuale di agarosio nel gel (% w/v)
Range di efficiente separazione di molecole di DNA lineare (kb) 0.3 5 - 60 0.6 1 – 20 0.7 0.8 – 10 0.9 0.5 – 7 1.2 0.4 – 6 1.5 0.2 – 3 2.0 0.1 – 2 La percentuale di agarosio nel gel determina la grandezza delle “maglie” e la capacità di risoluzione del gel stesso. Gel a basse concentrazioni di agarosio vengono usati per elettroforesi di molecole relativamente grandi di DNA, mentre gel ad alte concentrazioni di agarosio permettono un’efficiente separazione di molecole di DNA piccole.

5 Il DNA è carico negativamente a causa della presenza dei gruppi fosfato, quindi in presenza di un campo elettrico migrerà verso il polo positivo (ANODO) CATODO ANODO

6 DNA plasmidico DNA plasmidico linearizzato dsDNA di 500 bp dsDNA di 800 bp La velocità di migrazione delle particelle durante l’elettroforesi dipende da: CARICA il DNA è carico negativamente, quindi migrerà verso l’elettrodo positivo DIMENSIONE la velocità di migrazione di molecole lineari di dsDNA è inversamente proporzionale al log10 del numero di paia di basi FORMA molecole di DNA lineare migrano più velocemente rispetto a molecole di DNA circolari (plasmidi) m = q f q carica elettrica della particella f coefficiente frizionale m mobilità elettroforetica

7 ATTENZIONE: mutageno e cancerogeno!
Le molecole di Bromuro di Etidio si intercalano tra le basi del DNA a doppio filamento ed emettono luce fluorescente (arancio-rossa) quando irradiate con luce ultravioletta il Bromuro di Etidio viene aggiunto direttamente nella preparazione del gel di agarosio in modo da permettere la visualizzazione del DNA migrato durante l’elettroforesi ATTENZIONE: mutageno e cancerogeno!

8 I campioni di DNA vengono caricati nei pozzetti del gel dopo essere stati mescolati con il LOADING BUFFER 6x (buffer di caricamento), che: contiene glicerolo, che aumenta la densità del campione evitando che fuoriesca dal pozzetto durante il caricamento; contiene sostanze coloranti (Blu di bromofenolo e Xilen-cianolo) che permettono di seguire la corsa elettroforetica. In un pozzetto del gel viene caricato un marcatore di peso molecolare (marker), cioè del DNA di dimensioni note con cui confrontare i propri campioni 900 bp 800 bp 180 bp 500 bp 320 bp 750 bp 80 bp 150 bp Marker A B C

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10 Preparazione di un gel di agarosio al 2% ed elettroforesi di DNA
Preparare il vassoio per colare il gel nella “slitta” e inserire i “pettini” necessari per la formazione dei pozzetti di caricamento Pesare 2 grammi di agarosio e metterli in una beuta da 250 ml Aggiungere nella beuta 100 ml di TBE 0.5x (diluire dalla soluzione stock di TBE 5x), mescolare e portare ad ebollizione nel microonde fino alla completa solubilizzazione dell’agarosio Aggiungere alla soluzione di agarosio 5 ml di Bromuro di Etidio a concentrazione 10 mg /ml (concentrazione finale 0.5 mg/ml) e mescolare Lasciar raffreddare la soluzione di agarosio e versarla nel vassoio contenente il pettine prima che solidifichi; nel frattempo preparare i campioni da caricare: 15 ml di reazione di PCR + 3 ml di loading buffer 6x marker di peso molecolare Ad avvenuta solidificazione del gel porre il vassoio con il gel nella camera elettroforetica e riempirla con il TBE 0.5x fino a ricoprire completamente il gel; rimuovere delicatamente il pettine Caricare i campioni nel gel, collegare la camera elettroforetica agli elettrodi tenendo conto che gli acidi nucleici migrano verso il polo positivo (anodo) ed effettuare la corsa elettroforetica a voltaggio costante (100 V) Interrompere la corsa elettroforetica prima che il blu di bromofenolo fuoriesca dal gel Analizzare la corsa elettroforetica ponendo il gel sopra un transilluminatore a luce ultravioletta IMPORTANTE! Il Bromuro di Etidio è un agente mutageno e cancerogeno: dall’aggiunta di Bromuro di Etidio in poi indossare sempre i guanti