Parte 5 Estrazione e quantificazione (Maggiore Iacovacci)

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1 Parte 5 Estrazione e quantificazione (Maggiore Iacovacci)
Genetica Forense (6 CFU) – Fulvio Cruciani Laurea Triennale in Scienze Biologiche Sapienza Università di Roma

2 Estrazione & Quantificazione del DNA estratto
Magg inv sc Giuseppe IACOVACCI Direttore della Sezione 4^ della Banca Dati Nazionale del DNA

3 ESTRAZIONE DEL DNA DAL CAMPIONE

4 Walsh et al Biotecniques 1991; 10: 506
IL PROTOCOLLO CHELEX Walsh et al Biotecniques 1991; 10: 506 Prevede la bollitura della traccia in una sospensione acquosa al 5% della Resina Chelex 100 e l’utilizzo diretto del supernatante in PCR. Rapido (da 15’ a 90’), economico (meno di €/reazione) e con altissima resa (fino al 98%) Ha il difetto di produrre un estratto poco “pulito” e che si degrada in tempi brevi se conservato a +4° inoltre è diluito in un volume che supera i 300 ul Reperti ammessi.

5 PROTOCOLLO CLASSICA METODO SINGLE TUBE
Sambroock et al Molecular cloning 1988 adattato da McIndoe et al Biotecnicques 1995; 19: 30 Prevede diverse fasi condotte in una unica provetta vacutainer con resina, fino alla precipitazione etanolica o filtrazione su microcon. Il protocollo è stato scomposto in punti successivi che possono essere adattati ai diversi reperti. Laborioso, prevede l’uso di solventi organici, resa circa 40% Purifica discretamente adattabile ad un ampia tipologia di tracce Reperti ammessi. 1 Pretrattamento 2 Digestione 3 Estrazione organica STAIN EXTRACTION BUFFER Composizione.- 10 mM Tris-HCl pH 8.0 >>>>>>>1: 100 di una madre 1 M 100 mM NaCl > MW 58.44>>>>>5.8 g\l 10 mM EDTA >MW >>>>>3.7 g/l del sale sodico diidrato 2% SDS >>>>>>>>>>>>>>>>>>>20 g\l 39 mM DTT > MW 154.2>>>>>>>6.2 g\l Rif. Techinical manual GenePrintTM STR System (Silver Stain Detection) Revised 5/98

6 Estrazione Differenziale I

7 Estrazione Differenziale II
Utilizzabile per aumentare il processamento nei casi di violenze sessuali

8 Campionamento delle impronte mediante tamponi Prionics® con acetone e eluente del kit Hexagon OBTI®

9 Utilizzo di resine di silice
Il metodo si basa sull’affinità che il DNA, trattato con sali caotropici (isotiocianato di guanidinio), ha verso la silice. EZ1 QIAcube

10 Quantificazione del DNA in genetica forense

11 Importanza della quantificazione

12 Importanza della quantificazione

13 Importanza della quantificazione

14 Eccesso di DNA in amplificazione
Difetto di adenilazione Pull up Aumento del rumore di fondo Pull up

15 Difetto di DNA in amplificazione
In queste condizioni l’analisi risulta affetta da problemi stocastici in questo caso dobbiamo interpretare il dato con un approccio LCN o LT

16 Normalizzazione Effettuabile con un liquid handler in automatico sulla base della quantificazione a meno di misture

17 Metodi per la quantificazione del DNA
DOT-BLOT ELETTROFORESI GEL AGAROSIO LA SPETTROFOTOMETRIA “UV” LA FLUORIMETRIA

18 Real Time PCR: metodo attualmente usato per la quantificazione del DNA in genetica forense

19 Focus sulla quantificazione del DNA mediante real time PCR
Magg inv sc Giuseppe IACOVACCI Direttore della Sezione 4^ della Banca Dati Nazionale del DNA

20 Cinetica della PCR

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22 Scelta della Chimica

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26 Power Quant® (Metodo per la quantificazione mediante real time PCR tarato sulle esigenze della genetica forense)

27 Sensibilità nominale al pg
Ottimale rilevazione di inibitori Buon monitoraggio della degradazione Buon potere predittivo sui misti Maschio/Femmina Solo 4 punti per la curva standard