SISTEMA IMMUNITARIO Sistema complesso caratteristico dei vertebrati con funzioni di sorveglianza dell’ambiente interno e difesa dall’invasione di materiale.

Presentazione sul tema: "SISTEMA IMMUNITARIO Sistema complesso caratteristico dei vertebrati con funzioni di sorveglianza dell’ambiente interno e difesa dall’invasione di materiale."— Transcript della presentazione:

1 SISTEMA IMMUNITARIO Sistema complesso caratteristico dei vertebrati con funzioni di sorveglianza dell’ambiente interno e difesa dall’invasione di materiale ‘non-self’ (e quindi potenzialmente patogeno) L’osservazione della capacità di acquisire un’immunità verso molti patogeni è molto antica, Tucidide V sec. A.C. solo i sopravvissuti alla peste potevano curare i malati

2 1798  Jenner, primo vaccino contro il vaiolo
Pasteur ( )  sviluppo anche di altri vaccini 1890  viene dimostrato che il siero di animali immunizzati contro la difterite è in grado di trasferire lo stato immune ad altri animali (risposta immunitaria umorale), solo nel 1930 vengono identificati i mediatori di questo trasferimento (gli anticorpi o immunoglobuline) In alcuni casi per il trasferimento dell’immunità è necessario il trasferimento di cellule (immunità cellulo-mediata)

3 Immunità innata e Immunità adattativa
La prima è solo parzialmente specifica, interviene in tempi molto brevi, spesso è sufficiente a evitare il diffondersi dell’infezione Nei casi in cui ciò non si verifica entra in gioco la Risposta Immunitaria Adattativa

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5 Risposta immunitaria adattativa è caratterizzata da:
Specificità  Ag diversi inducono risposte diverse Diversificazione  capacità di rispondere a moltissimi Ag diversi Memoria  potenziamento in caso di secondo incontro con il medesimo Ag Non reattività verso il self E’ divisa in due fasi: RICONOSCIMENTO del ‘non-self’ RISPOSTA (neutralizzazione)

6 Le cellule del sistema immunitario con funzioni di riconoscimento

7 Risposta primaria e risposta secondaria

8 STRUTTURA DELLE Ig (mediatori della risposta adattativa)

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10 Digestione parziale con enzimi proteolitici

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12 L’IMPORTANZA DELLA REGIONE CERNIERA

13 La scoperta che individui affetti da mieloma multiplo (tumore derivato da una plasmacellula) producono in grande quantità Ig con un’unica specificità antigenica, ha reso possibile il sequenziamento delle catene leggere (L) e pesanti (H) delle Ig Il confronto delle sequenze ottenute da pazienti diversi ha evidenziato che sia le catene L che le H presentano una porzione Costante (ca.110 aa nelle catene L e ca. 330 o 440 nelle H) che è pressoché uguale in tutte le Ig e una porzione Variabile (ca. 110 aa sia per le catene L che per le H) specifica per la singola Ig

14 Sulla base della sequenza amminoacidica della porzione costante le catene pesanti possono essere suddivise in 5 differenti classi (e alcune classi possono essere suddivise in sottoclassi) che vengono indicate con lettere dell’alfabeto greco (a, g, d, e, m) Le catene leggere possono essere suddivise in 2 differenti tipi (k e l) e le k in sottotipi

15 Le catene pesanti g, d e a hanno 3 domini C
Le catene pesanti m e e hanno 4 domini C

16 LE CINQUE CLASSI DI Ig

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18 Le Ig vengono prodotte come proteine secrete o di membrana

19 (no. aminoacidi diversi)/(frequenza aa. più comune)
LE TRE REGIONI IPERVARIABILI (CDR = Complementarity Determining Region) DEL DOMINIO VARIABILE Le CDR delle catene L ed H vengono a trovarsi spazialmente vicine nella struttura quaternaria  sito di legame per l’Ag La variabilità per ciascuna posizione è misurata con il seguente indice: (no. aminoacidi diversi)/(frequenza aa. più comune)

20 La struttura delle Ig presenta alcune caratteristiche difficili da conciliare con i modelli genetici classici dell’epoca in cui la loro struttura è stata in gran parte chiarita Enorme diversità (= grande repertorio, dell’ordine di ) in ciascun individuo Presenza nella stessa molecola di una regione variabile (sostanzialmente unica, cioè presente solo in quel clone cellulare) e di una regione costante condivisa da molti cloni Presenza di Ig di classi diverse ma con la stessa specificità antigenica

21 Dreyer e Bennett ipotizzano che sia le catene pesanti che le leggere siano codificate da due segmenti genici distinti che in qualche modo ad un certo stadio dello sviluppo dei linfociti riarrangiano e formano un unico gene che viene trascritto e tradotto (viene contraddetto il dogma un gene  una catena polipeptidica) Essi inoltre ipotizzano l’esistenza di molti (centinaia o migliaia) segmenti V e di pochi segmenti C

22 Solo nel 1976 si è avuta la prova definitiva della sostanziale esattezza di questa ipotesi
Hozumi e Tonegawa  confronto tra i DNA estratti da cellule di mieloma e da cellule embrionali digeriti con RE e ibridati con due sonde: una corrispondente al completo mRNA della Ig, l’altra ottenuta dalla porzione 3’ dell’mRNA della Ig  il pattern di bande ottenute con queste due sonde è diverso nei due DNA

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24 Sonda mRNA completo: due bande dal DNA embrionale e una sola dal DNA di mieloma (diversa dalle due del DNA embrionale) Sonda mRNA 3’: una sola banda sia dal DNA embrionale che da quello di mieloma ma di dimensioni diverse

25 Organizzazione dei cluster genici delle catene leggere e delle catene pesanti delle Immunoglobuline nell’uomo

26 Catene L: il riarrangiamento (V-J) a livello di DNA porta alla formazione di un gene funzionante

27 Catene H: ricombinazione V-D-J

28 Il linfocita B maturo che non ha ancora incontrato l’Ag esprime mIgM e mIgD
Splicing alternativo

29 Il riarrangiamento avvicina sequenze Promotrici e sequenze Enhancer

30 Esiste un polimorfismo sia per numero di copie che per SNV
Grandezza del repertorio anticorpale generato dall’unione dei diversi tipi di segmenti (diversità combinatoriale) Il no. esatto dei segmenti V e D non è noto e probabilmente varia da individuo a individuo Esiste un polimorfismo sia per numero di copie che per SNV La diversità combinatoriale genera un repertorio grande, ma inferiore a quello che realmente ciascuno di noi ha Quali sono gli altri meccanismi responsabili della grande variabilità osservata?

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32 L’analisi del cluster IGH in altri 9 soggetti ha portato all’individuazione di ulteriori 7 SVs

33 La porzione Variabile è codificata dai segmenti genici riarrangiati:
V e J nelle catene leggere V, D e J nelle catene pesanti

34 COME AVVIENE LA RICOMBINAZIONE DEI VARI SEGMENTI GENICI ?
Sono necessarie sequenze segnale che fiancheggiano le regioni che devono essere unite e sistemi enzimatici (sia ubiquitari che linfocita-specifici)

35 STRUTTURA DELLE SEQUENZE SEGNALE (RSS = Recombination Signal Sequence)

36 Struttura delle RSS e loro localizzazione regola one-turn, two-turn
Eptamero e nonamero presentano un elevato grado di conservazione, in modo particolare nei nt adiacenti ai tratti che devono essere riuniti

37 Riconoscimento delle RSS da parte di RAG-1 e RAG-2 (complesso enzimatico linfocita-specifico) e sinapsi delle RSS  i due segmenti genici vengono avvicinati Taglio di un singolo filamento di DNA Taglio del secondo filamento e formazione di ‘forcine’ a protezione delle estremità tagliate Taglio casuale delle forcine Riunione delle estremità catalizzata dal complesso enzimatico DSBR (Double Strand Break Repair)

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39 Le forcine vengono spesso tagliate in modo da creare estremità ‘appiccicose’  vengono aggiunti nt. (P = palindromici); altra fonte di variabilità è l’aggiunta e/o la delezione di altri nt. (N)

40 Aggiunta di nucleotidi P e N

41 Linfociti che utilizzano gli stessi segmenti generano geni diversi

42 Il prezzo da pagare è la possibilità che si verifichino riarrangiamenti non produttivi  si stima che solo nel 10% dei pre-linfociti si verifichino riarrangiamenti produttivi per le catene L e per le H

43 I punti di giunzione possono variare
I punti di giunzione possono variare. Questa flessibilità giunzionale può dare origine a riarrangiamenti non produttivi Si stima che solo nel 10% dei pre-linfociti si verifichino riarrangiamenti produttivi per le catene L e per le H

44 In ciascun linfocita B viene espresso un solo allele per le catene pesanti ed un solo allele per le catene leggere (esclusione allelica)

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46 MATURAZIONE DEI LINFOCITI B
Riarrangiamento dei segmenti genici della catena pesante  produzione di catene m (e d) da un solo allele Riarrangiamento dei segmenti genici della catena leggera k  produzione di una IgM (e IgD) completa (con catene k prodotte da un solo allele) Se lo step 2. non è stato produttivo, si ha riarrangiamento dei segmenti genici della catena l  produzione di una IgM completa (con catene l prodotte da un unico allele) Se non si arriva alla formazione di un gene VH E di un gene VL funzionanti il pre-linfocita non sarà in grado di produrre alcuna Ig e morirà per apoptosi

47 Riarrangiamento produttivo del 1° allele  blocca il riarrangiamento del 2° allele – Nessuno dei due alleli effettua un riarrangiamento produttivo  morte per apoptosi

48 Origine della variabilità nelle tre CDR

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50 Ig dello stesso isotipo e con uguale regione V vengono prodotte sia come proteine di membrana che secrete attraverso un meccanismo di splicing alternativo

51 Eventi di splicing alternativo producono anche Ig con la stessa regione variabile ma diversa regione costante

52 Un altro fenomeno caratteristico dei linfociti B è l’ipermutazione somatica  avviene solo in seguito al legame con l’Ag

53 Il processo di ricombinazione somatica per generare le catene H e L delle Ig espone i linfociti al rischio di riarrangiamenti cromosomici anche al di fuori dei cluster dei geni per le Ig

54 Riarrangiamenti tra RSS ‘vere’ (nere) e sequenze RSS simili (cRSS=cryptic RSS, si stima che siano molto numerose nel genoma)  traslocazioni o delezioni o inversioni con possibile formazione di geni ibridi

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56 Differenze isotipiche
Individui della stessa specie presentano tutti gli stessi isotipi. Il numero di diversi isotipi varia da specie a specie Differenze allotipiche Si riscontrano tra individui della stessa specie Differenze idiotipiche Si riscontrano tra linfociti B dello stesso individuo

57 Le cellule del sistema immunitario con funzioni di riconoscimento

58 TCR = T Cell Receptor Proteina di membrana dei linfociti T, scoperta e caratterizzata all’inizio degli anni ’80, non esiste la forma secreta

59 TCR = T Cell Receptor

60 Isolamento del TCR-mRNA
Linfociti B e T esprimono in comune il 98% dei geni Il cDNA del clone 1 ha tutte le caratteristiche di un gene per il TCR: Codifica una proteina di membrana E’ espresso nei linfociti T e non nei B Va incontro a riarrangiamento nei linfociti T

61 I cluster genici del TCR nell’uomo

62 La ricombinazione dei segmenti genici del TCR

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64 locus ‘geni’ V ‘geni’ D ‘geni’ J ‘geni’ C Catena alfa Catena beta Catena gamma Catena delta 45 48 6 8 2 3 50 13 5 4 1

65 I meccanismi di generazione della diversità nelle Ig e nei TCR

66 Il tipo di risposta effettrice dipende da quale cellula ha riconosciuto l’antigene (linfocita B, TH o TC)

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69 Le molecole accessorie sono necessarie per l’espressione del TCR in membrana e per la trasduzione del segnale dopo il legame con l’antigene

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72 Linfociti B e T diversi producono BCR e TCR diversi perché HANNO geni diversi e NON perché ESPRIMONO geni diversi BCR e TCR  il repertorio (capacità di riconoscimento) della singola cellula è 1, il repertorio dell’individuo è elevatissimo (108)