The Nobel Prize in Physiology

Presentazione sul tema: "The Nobel Prize in Physiology"— Transcript della presentazione:

1 The Nobel Prize in Physiology
DNA in bacteria 1963 – R. Dulbecco and M. Vogt discover that the double stranded DNA of the Polyoma Virus exists in a closed circular form Today – it is generally accepted that the ccDNA is the typical form of bacterial DNA and cytoplamatic DNA in animals. The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1975

2 In bacteria Circularly closed DNA genome Right-handed (negative)
superhelix Left-handed (positive) superhelix Circularly closed DNA genome

3 Well known effect for the long time phone speakers

4 Chromatin fibers Shao lab. University of Virginia

5 In Eukaryotic cells It’s matter of scale

6 The nucleosome Manca roba

7 DNA circolare rilassato superavv. solenoidale superavv. plectonemico
Il DNA superavvolto può essere di tipo solenoidale o plectonemico (intrecciato)

8 A knotted situation Victoria Skeen, University of North Carolina and Chapel Hill

9 How does the cell succeeds to solve such a situation?
Topoisomerase II Topoisomerases The tailor of the cell Wang’s lab 1996

10 In virus capsid-highly packed
10 mm long linear DNA is packed in a nm size box Steve Harvey Lab. Bustamante Lab. Berkeley

11 How do we describe the topology of ccDNA?
Linking Number If the ends of the double helix are brought together, the # of times W passes around C is a Topological constant, which cannot be changed without cutting the strands. This number is called LINKING NUMBER Pulling the two strands apart without nicking them, the number of crossings does not change

12 Il numero di Linking Definizione: È il numero di volte che una catena di DNA è connessa ad un’altra in modo tale che se voglio disconnetterle devo rompere un legame covalente. Da una proiezione (come quelle sopra) si ottiene Lk sommando algebricamente il numero degli incroci (con il loro segno) e dividendo per 2. La somma algebrica serve a contare in modo appropriato gli incroci “veri” e distinguerli dalle sovrapposizioni della proiezione.

13 Computing the linking number
With six positive crossings and two negative crossings, these curves have linking number two.

14 Il numero di Linking Lk0 = 20

15 1 -1 2 -2 Il numero di Linking di due curve nello spazio è:
indipendente dalla proiezione scelta (è una proprietà topologica delle curve e non della proiezione spaziale scelta); Invariante per deformazioni continue delle curve, a meno che una delle curve non sia tagliata: è definito solo per DNA covalentemente chiusi. Lk è invariante se le due curve sono costrette su un piano o superavvolte nello spazio; Lk è sempre intero, siccome due curve possono essere connesse l’una all’altra solo un numero intero di volte; Il segno di Lk cambia se l’orientazione di una delle curve è invertita; l’operazione di riflessione rispetto ad un piano di simmetria genera due curve con Lk invertito di segno.

16 -1 c1 e -1 c2 Matematicamente, Lk può essere calcolato mediante l’integrale di Gauss: in cui: r la distanza che congiunge un punto x sulla curva C1 orientata e y sulla curva C2, T1 e T2 i versori tangenti in x e y, e è il versore lungo la direzione y–x e ds1 e ds2 gli elementi di arco su C1 e C2. T2 X T1 : vettore perpendicolare al piano T2 T1 sul loro vertice, con verso secondo la regola della mano destra, quindi equivale ad una rotazione e. (T2 X T1) la proiezione di e sul vettore T2 X T1 quindi equivale alla combinazione di una rotazione con una tranlazione: un elica!

17 Il numero di Linking del DNA rilassato
Lk0 = Tw0 Lk° è N/h, dove N è il numero delle basi e h le basi/spira,

18 Il numero di Twist del DNA
È il numero di volte che una catena si avvolge sull’altra. questo numero è positivo se l’elica è destrogira, negativo se è levogira. Il Twist (Tw) non è necessariamente un numero intero, e nella maggior parte dei casi non lo è. Generalmente, il Tw può essere definito tramite vettori ruotanti che puntino da una curva C1 all’altra C2. Per due curve che si avvolgono lungo un asse rettilineo, Tw è pari all’angolo di rotazione dei vettori diviso per 2π. In generale il Tw può non essere intero e cambia a seguito di deformazioni della curva C1 o della superficie che collega C1 a C2.

19 Il numero di Writhe È il numero di volte che l’asse dell’elica si avvolge su se stesso nello spazio. Il writhe (Wr) dipende solamente dalla traiettoria dell’asse della doppia elica nello spazio, non dal fatto che il DNA abbia 2 eliche avvolte l’una sull’altra. Wr non ha necessariamente un valore intero. Se la traiettoria del DNA giace su un piano, Wr è sempre 0. Wr=0 anche se la traiettoria del DNA giace su una superficie sferica. Come mostrato in una delle diapositive precedenti, il DNA può avvolgersi nello spazio in due modi, essenzialmente: se si avvolge attorno a se stesso lo fa generalmente nel modo plectonemico (intrecciato), se si avvolge intorno ad un oggetto, lo fa in modo solenoidale. In soluzione il writhe isomerizza tra le due forme.

20 Il superavvolgimento da osservazioni al microscopio
I metodi di microscopia ad alta risoluzione permettono di determinare direttamente la traiettoria dell’asse della doppia elica del DNA nello spazio (o più spesso in un piano) e seguire il “branching” ove la tensione elastica del superavvolgimento da vita a strutture plectonemiche ramificate. Un esempio: TEM di DNA superavvolto (si possono contare gli incroci ed avere una stima del Wr, ( non si determina il segno di Wr.) Una immagine AFM di DNA superavvolto (molecola di pBR322, 4361 bp): l’AFM ottiene direttamente informazioni tridimensionali e può determinare direttamente e semplicemente la traiettoria tridimensionale dell’asse molecolare della molecola osservata, per poterne calcolare il Wr: si determina direttamente la chiralità del superavvolgimento.

21 Computing the writhing number
crossing

22 Il calcolo del Wr per una molecola osservata
Con il metodo dei writhing delle proiezioni, considerando tutte le possibili proiezioni di questa curva da tutti i punti di vista possibili. La figura è quasi piatta, per cui la maggior parte delle intersezioni ha Wrp= –2, solo per alcune Wrp= –1, ad esempio. Il risultato di una media approssimata indica che Wr≈ –2. -1 Anche da immagini AFM di qualità inferiore è possibile ricavare informazioni sulla chiralità del superavvolgimento, anche se operazioni più complesse di analisi di immagine sono talvolta necessarie (analisi stratigrafica).

23 Il numero di Writhing è definito come la media del “writhing direzionale” di una curva su tutte le possibili proiezioni. Il writhing direzionale si ottiene sommando algebricamente gli indici assegnati a ciascun incrocio di una curva orientata con se stessa nello spazio, ai quali sia stato attribuito segno positivo o negativo secondo la convenzione per la quale si attribuisce segno positivo qualora sia necessaria una rotazione in senso antiorario per sovrapporre il vettore direzione della curva sovrastante a quello della curva sottostante attraverso l’angolo più piccolo possibile nella proiezione. Esempi di forme superavvolte toroidalmente e plectonemicamente con il loro Writhing approssimato . NB al contrario del Linking number non ho due curve indipendenti che si intersecano la cui direzione può cambiare, nel writing ho punti diversi su un’ unica curva che si avvolge

24 A differenza di Lk, anche cambiando l’orientazione della curva, Wr resta immutato in segno; Il metodo di calcolo matematico è l’integrale di Gauss: al contrario del Lk non ho due curve indipendenti che si intersecano la cui direzione può cambiare, nel Wr ho punti diversi su un’ unica curva che si avvolge e la sua chiralità non cambia con il punto di osservazione Con il calcolo dell’integrale di Gauss per via numerica, rilevando le coordinate spaziali di tutti i punti sull’asse del DNA direttamente dall’immagine AFM. Questo calcolo porta ad una stima di Wr= –1.98. -1 -1

25 In bacteria

26 Il numero di Linking di un DNA superavvolto
L’ introduzione di superavvolgimenti in una molecola di DNA (svolgimento o sovravvolgimento dell’elica destrogira prima della chiusura di una molecola lineare in una circolare) riduce o aumenta il numero di giri d’elica intrappolati dalla chiusura e risulta in un cambiamento del numero Lk delle specie circolari. ∆Lk= Lk–Lk° è la differenza di linking o deficit di linking, che può essere positivo o negativo. Nel DNA naturale, ∆Lk<0, essendo questo sottoavvolto rispetto al DNA lineare = (Lk–Lk°)/Lk° detto differenza di linking specifica (densità di superavv.) Nel DNA naturale, = –0.06, in media: sottoavvolto di un giro di Tw ogni 17 della doppia elica destrogira. Lk = Tw + Wr ∆Lk= Lk–Lk° = ∆ Tw + Wr

27 Il legame tra Tw, Wr e Lk Lk=Tw+Wr
La relazione fondamentale che lega i tre descrittori del superavvolgimento è: Lk=Tw+Wr Che lega una proprietà topologica, il linking (intero), con due proprietà geometriche, il twisting ed il writhing (interi o frazionari). Per ogni valore di Lk, esiste una distribuzione di forme all’equilibrio che ripartiscono il Tw ed il Wr in modo differente. Nelle forme a basso Wr (in valore assoluto), la tensione torsionale è principalmente a carico del twist dell’elica (l’elica è sotto tensione, con un numero diverso di basi/spira rispetto allo stesso DNA lineare in soluzione); nelle forme ad alto Wr, la tensione torsionale è scaricata grazie al superavvolgimento dell’asse dell’elica, mentre localmente il DNA non è alterato. ∆ Alcuni esempi: Un nastro con Lk=0, Tw=0 e Wr=0 Un nastro con Lk ≈ –2, Tw ≈ 0, Wr≈ –2 ∆ ∆ ∆ ∆

28 Fluttuazioni conformazionali di plasmidi (dsDNA) superavvolti
L’AFM può osservare campioni in fluido, in modo che questi siano liberi di muoversi sulla superficie. Nella sequenza di immagini a fianco, lo stesso gruppo di molecole sono state osservate durante un lungo intervallo di tempo, in condizioni di adesione diversa sulla superficie, in modo da poterne modulare la dinamica. Si possono notare le dimensioni dei loops cambiare.

29 SFM observation of the dynamics
of supercoiled DNA in solution (2nd part)

30 Molte tecniche di simulazione al calcolatore sono state utilizzate per prevedere e quantificare la forma del DNA superavvolto Simulazione con = –0.06

31 Come si ripartisce mediamente la tensione fra il Tw ed il Wr?
( 620 giri invece di 660: sottoavvolto del 40/660= 6%) ( tende a superavvolgersi più che a twistarsi) Come si ripartisce mediamente la tensione fra il Tw ed il Wr?

32 Dalle osservazioni al microscopio, congiunte a quelle biochimiche si è giunti alla conclusione che il ∆Lk si ripartisce per circa il 70% in writhing e per il restante 30% in twisting. Questa ripartizione dipende dal rapporto tra le elasticità torsionale e assiale del DNA: se costa molta più energia torcere il DNA che piegarlo, allora la tensione elastica del sottoavvolgimento si scarica soprattutto sul writhe, che consente di recuperare una torsione di equilibrio; viceversa, se costa molta più energia piegare il DNA piuttosto che torcerlo, la tensione dell’avvolgimento si localizzerà prevalentemente a livello di twisting, senza aumentare il writhing (che comporta una piegatura più accentuata di sezioni del DNA). Si può prevedere che sezioni del DNA che possono assumere forme curvate, siano più facilmente localizzate nei “loop” delle forme intrecciate, piuttosto che nei pressi degli incroci, dove il DNA è più dritto. Si può comunque prevedere che la barriera energetica per l’interconversione sia piuttosto bassa, probabilmente sotto kT, per cui possa facilmente avvenire uno slittamento del DNA che, associato al “branching” consentirà ad un tratto di DNA di essere presente alternativamente in zone di loop o di incrocio.

33 Un campione di DNA superavvolto al microscopio: nella maggioranza delle preparazioni sono compresenti molecole superavvolte, molecole circolari “nicked” che restano rilassate e molecole lineari (la frazione di queste ultime forme aumenta se il campione viene “maltrattato” perché il DNA sotto tensione di superavvolgimento è fragile e basta anche un solo “nick” per permettergli di rilassare il superavvolgimento).

34 La misura sperimentale del superavvolgimento:
La scoperta del DNA circolare e superavvolto risale al lavoro di Vinograd del 1963, avvenuta grazie a studi di velocità di sedimentazione di DNA di polyoma virus. La mobilità elettroforetica del DNA superavvolto dipende dal grado di superavvolgimento: è facile, in opportune condizioni, distinguere i vari topoisomeri. La mobilità elettroforetica aumenta in modo monotono con l’aumento del valore assoluto del numero di Linking. Questo è dovuto al fatto che topoisomeri dotati di maggiore differenza di linking, hanno maggiore writhe, per cui sono più compatti. Questo è vero a meno che non avvengano transizioni conformazionali che alterino lo stress del superavvolgimento.

35 T2 DNA undergoing electrophoresis: fluorescence microscopy
Immagini di S. Gurrieri e collaboratori Una molecola di DNA di T2 durante elettroforesi

36 L’effetto degli intercalanti:modifico il twist
Un intercalante contiene una struttura planare aromatica, usualmente policiclica, che si può inserire tra due coppie di basi del DNA. Questo causa uno svolgimento locale dell’elica, che risulta in un incremento del numero di basi per spira (helical repeat) quindi una diminuzione del twist. Ad esempio, il Bromuro di etidio lega fortemente il DNA a doppia catena (ed ha un grande incremento della fluorescenza quando è legato) ed il legame di ogni molecola di etidio causa uno svolgimento locale di 26°. Bromuro di etidio Clorochina Dall’equazione generale ∆Lk= ∆Tw + Wr, un decremento del Tw corrisponde ad un incremento del Wr, per cui un aumento della quantità di etidio nel DNA corrisponderà ad una transizione verso valori sempre più positivi di Wr. Si noti che la concentrazione di 1µg/ml utilizzata abitualmente per la gel elettroforesi satura completamente il DNA di etidio.

37 Quando una molecola di Etidio Bromuro intercala il DNA l’ helical twist passa da 36° a 10° ed il rise di 3.3 A° sulla direzione assiale raddoppia. Quando inserisco una molecola di Etidio ogni 2 coppie di basi, che é il massimo possibile, quale diventerà la lunghezza massima di un tratto di 100 coppie di basi in struttura B? 50 X X 6.6= 495 Quale sarà il numero totale di giri che questo conterrà? (50 X X10) /360 = 6.4 giri

38 L’effetto del bromuro di etidio sul DNA superavvolto
+EthBr +EthBr Wr<0 Wr=0 Wr>0 +EthBr Topoisomerasi I –EthBr Wr=0 Wr>0 Wr=0 Wr<0 Le topoisomerasi sono enzimi che agiscono sullo stato topologico del DNA, tagliandolo e ricucendolo. La Topoisomerasi I, ad esempio, rilassa il DNA superavvolto (riduzione del Wr).

39 Il superavvolgimento da esperimenti di gel-elettroforesi
Per i campioni di DNA superavvolto nativo di tipo circolare (plasmidi), la distribuzione di topoisomeri è spesso molto stretta ed a valori molto alti, per cui non è facile distinguere su una normale elettroforesi i vari topoisomeri che costituiscono la popolazione. pBR322 nativo Pozzetti Circolare rilassato Lineare Superavvolto Una corsa elettroforetica di DNA superavvolto con ∆Lk variabile da 0 a 8. Ogni banda contiene DNA assolutamente uguale (stessa sequenza, lunghezza e peso molecolare) che differisce solo per Lk. OC rappresenta DNA “open circular” in cui le catene fosfoesteree sono state rotte almeno in un punto di una catena, per cui il DNA può rilassare, mantenendo una forma circolare. Una digestione con un enzima di restrizione avente un sito unico su questo DNA produrrebbe una sola banda del lineare che in un gel elettroforetico generalmente migra più velocemente di OC.

40 Gel elettroforesi + intercalanti
Nel 1975, Keller introdusse un metodo nuovo per caratterizzare il Lk del DNA superavvolto: l’introduzione di una quantità variabile di bromuro di etidio nel DNA durante la corsa elettroforetica modifica lo stress del superavvolgimento, in ragione di N/360, dove  è il numero di molecole di intercalante che si lega per coppia di basi,  è l’angolo di svolgimento della doppia elica indotto dall’intercalante, N è il numero di coppie di basi. Una quantità opportuna di etidio aggiunta al DNA “nativo” (che è molto sottoavvolto e appare come una sola banda a migrazione veloce) lo svolge parzialmente fino a ridurre il Wr sì da portarlo in un campo in cui i vari topoisomeri hanno mobilità visibilmente dipendente dal grado di superavvolgimento. a b Lo stesso DNA nativo di SV40 fatto migrare su tre distinti (simili) gel elettroforetici contententi 0 (a), (b) di etidio bromuro. In (a) si notano solo la banda contenente tutti i topoisomeri, in (b) i topoisomeri sono stati separati grazie all’intercalazione. Se sono contenuti e risolti tutti i topoisomeri da Lk=0 a Lk nativo, uno può semplicemente contare il valore di Lk.

41 Un modo per contare ed assegnare direttamente i topoisomeri è l’elettroforesi bidimensionale,(con aggiunta di intercalante fra le due corse) la cui introduzione si deve a James Wang

42 Un esempio reale di elettroforesi bidimensionale con aggiunta di intercalante per un campione contenente molti topoisomeri La risoluzione nella prima dimensione giunge a saturazione per topoisomeri oltre il 18-esimo. La seconda direzione, con clorochina, separa i topoisomeri molto sottoavvolti

43 Un breve accenno sul comportamento termodinamico del DNA superavvolto
Il grado di superavvolgimento del DNA dipende dal passo dell’elica (svolgendo l’elica, il superavvolgimento diviene più positivo). Studiare il superavvolgimento consente di avere informazioni anche sul passo dell’elica. Indipendentemente, Wang e Vinograd determinarono il comportamento termico del DNA superavvolto. Rilassarono aliquote diverse dello stesso campione di DNA superavvolto a temperature diverse, poi separarono i topoisomeri sullo stesso gel elettroforetico. Le differenze tra le distribuzioni dei topoisomeri erano dovute al diverso passo dell’elica al momento del rilassamento. La determinazione quantitativa porta al risultato che l’elica del DNA si svolge di 0.012° per coppia di basi per °C. Questo non sembra molto, ma per una molecola di DNA reale di, ad es., 10 kbp il riscaldamento da 20 °C a 35 °C porta ad uno svolgimento di 5 giri! In modo analogo fu possibile per Wang misurare il passo dell’elica del DNA in soluzione. Utilizzando una serie di DNA che differivano solo di poche coppie di basi (es. 11, 25, 36) Wang misurò il contributo di svolgimento delle basi aggiuntive e confermò il valore di 10.4 bp/spira determinato in precedenza dalla cristallografia a raggi X. In seguito, questo valore fu anche confermato da Klug che ottenne 10.6 bp/spira digerendo con nucleasi del DNA adsorbito sulla superficie della mica.

44 The existence of this effect might have been already inferred many years ago from the data that made it possible to Rhodes and Klug to determine the pitch of the DNA double helix. DNA tracts adsorbed on an inorganic surface, show Dnase I cutting sites with 10.6 bp periodicity in foot-printing experiments. They observed that .. assumed two preferred azimuthal orientation due to some anchorage to the surface because of the melting of the terminals Nature, 286, 573 (1980) In order to justify this result they had to. Very few people were convinced that this was the case. Now we understand what made that very classical experiment work.

45 L’avvolgimento del DNA nel tempo al variare della forza ionica

46 La dipendenza del superavvolgimento dalle condizioni ambientali
 è la densità di superavvolgimento La dipendenza del superavvolgimento con la temperatura è tale che ∆/ ∆T=3.1·10-4 gradi-1 Il segno positivo significa che  aumenta, cioè la doppia elica si svolge, aumentando la temperatura (una variazione di 30 °C causa un cambiamento di  di 0.01, il 20% del livello nativo di superavvolgimento!) La dipendenza del superavvolgimento dalla forza ionica è tale che un aumento della forza ionica porta ad un decremento di  cioè avvolge la doppia elica. Perché? ∆/ ∆pX+ è positivo e dipende dallo ione che determina il cambiamento. Per gli ioni monovalenti (Na+, K+, Li+, NH4+) a concentrazioni tra 0.05 e 0.3 M, ∆/ ∆pX+=4.5·10-3. Gli ioni divalenti hanno un’influenza ancora superiore sul superavvolgimento (talvolta si usa il Ca2+ per preparare DNA a livello controllato di superavvolgimento positivo.) Perché?

47 Le strutture non canoniche del DNA
Gli studi sui campioni di DNA circolare isolati dalle cellule mostra che la densità di superavvolgimento varia anche notevolmente, da –0.03 a –0.1. La distribuzione dei topoisomeri in natura si descrive bene con una gaussiana. Per un DNA di 5000 bp, ci sono in media da 20 a 30 superavvolgimenti e si determina che in una preparazione sono contenuti circa 10 topoisomeri in frazioni comparabili. Talvolta, la distribuzione dei topoisomeri nel DNA isolato da cellule è più larga di quella di equilibrio termico (ligando in vitro il DNA tagliato): si è visto che il grado di superavvolgimento e la distribuzione dei topoisomeri in vivo dipende fortemente dalla fase della vita cellulare. Nella fase di crescita logaritmica, la distribuzione dei topoisomeri è più stretta che nella fase stazionaria. Le strutture non canoniche del DNA Strutture come la forma Z-DNA o il DNA cruciforme possono essere favorite dalla tensione di superavvolgimento. Nella elettroforesi bidimensionali a sinistra si vede il risultato della corsa di un campione contenente topoisomeri di pBR322. Si noti come la risoluzione nella prima direzione si perde per i topoisomeri oltre il 18-esimo. La seconda direzione, con clorochina, separa i topoisomeri molto sottoavvolti. A destra, nel pBR322 è stato inserito un frammento d(GC)16. Si nota che al topoisomero 18’ c’è un salto dovuto ad un rilassamento brusco della tensione di superavvolgimento causata da una transizione conformazionale BZ. B-DNA: 10.5 bp/turn; 2.0 nm diameter A-DNA: 11.0 bp/turn; 2.6 nm diameter Z-DNA: 12.0 bp/turn; 1.8 nm diameter The Energy of supercoiling can be used to stabilize unfavourable conformations = (Lk–Lk°)/Lk° La formazione di cruciformi è un processo altamente cooperativo. L’elettroforesi 2D di destra mostra una transizione B->Z sotto stress torsionale: La banda 20 passa da ∆ Lk= –15.5 a ∆ Lk= –9.5, per cui perde 6 giri. 32 nt d(GC)16 possono B–>Z, per cui perdono 32/ giri d’elica, cioè 5.7 giri! Abbiamo quindi verificato che si tratta di una transizione B–>Z

48 Z-DNA Nella forma Z le purine sono sempre syn.
La forma anti è sempre favorita nell’A e B-DNA Lo Z-DNA è un’elica sinistrorsa che si instura in sequenze con alternanza purina/pirimidina (CGn) in cui le basi assumono conformazioni alternate syn/anti.

49 Supponiamo che il ∆Lk di un plasmide di 8000 coppie di basi risulti in elettroforesi essere -40 e che questo ∆Lk, invece di ripartirsi in Wr ed in ∆Tw, venga tutto riversato in Wr. Se lo stesso DNA transita dalla forma B alla forma Z su un tratto di venti coppie di basi, tenendo in considerazione i diversi passi ed il diverso senso di avvolgimento delle due doppie eliche, calcolare come questa transizione su venti coppie di basi modifichi il numero di avvolgimenti di questo DNA e quindi di quanto venga rilasciata la tensione torsionale? B 10 bp/giro destrogiro; Z 12 bp/giro levogiri; 20 basi in B sono 2 giri RH in Z 1.6 LH. si svolge per 3.6 giri

50 Sequenze palindromiche possono estrudere strutture cruciformi
In modo simile si possono formare le giunzioni di Holliday

51 Anche la formazione di cruciformi è un modo per scaricare la tensione del superavvolgimento del DNA (in modo quantitativamente diverso dalla formazione del Z–DNA.) Anche questo tipo di transizione si può studiare con le elettroforesi bidimensionali. Il grado di svolgimento è pari al numero di giri d’elica che subiscono l’estrusione del cruciforme, poiché nel cruciforme le catene non sono avvolte una rispetto all’altra.

52 Il superavvolgimento negativo (ottenuto mediante legame in forma di superelica sinistrorsa con le proteine) è un modo per immagazzinare tensione elastica che può essere spesa per svolgere un certo numero di spire d’elica, processo necessario per il funzionamento degli enzimi che interagiscono con una catena del DNA alla volta (le polimerasi, ad esempio.