(integrato o episomiale)

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1 (integrato o episomiale)
Virus oncogeni La trasformazione cellulare da virus si accompagna ad una infezione persistente/latente (non controllata dal sistema immune) con espressione solo di alcuni geni precoci del genoma virale che rimane nella cellula (integrato o episomiale)

2 Virus a DNA Virus a RNA Herpes virus (EBV, HHV-8)
Papovavirus (HPV, BKV, JCV, SV40) Hepadnavirus (HBV) Adenovirus Poxvirus (virus mollusco contagioso –neoformazioni benigne) Virus a RNA Flavivirus (HCV) Retrovirus (HTLV-I e – II)

3 Caratteristiche della particella virale di HPV (Human Papilloma Virus)
NO envelope Icosaedrico 52-55 nm di diametro dsDNA circolare 8Kb Capside a 72 capsomeri composti dalle proteine L1 (55 KDa) e L2 (70 KDa)

4 Papillomavirus HPV E6 LCR E7 L1 E1 HPV-16 E4 L2 E5 E2 P97 AL AE 7904/1
2000 3000 HPV-16 LCR E6 E7 E1 E2 E4 E5 L2 L1 AL P97 AE 1000 4000 5000 6000 7000 7904/1

5 La replicazione è associata allo stadio differenziativo della cellula
HPV ha tropismo specifico per le cellule degli epiteli squamosi cheratinizzati e non La replicazione è associata allo stadio differenziativo della cellula

6 Replicazione HPV

7 Fibropapilloma -Ibridazione in situ
Replicazione di HPV Fibropapilloma -Ibridazione in situ Controllo negativo HPV L1 E5 Barksdale et al, J. Virol. 1993

8 Principali funzioni delle proteine di HPV

9 Lesioni associate all’infezione da HPV
HPV causa lesioni epiteliali benigne caratterizzate da intensa proliferazione delle cellule basali e, conseguentemente, da un ispessimento locale dell’epitelio (DNA episomiale) HPV è associato con lo sviluppo di lesioni displastiche pre-neoplastiche e carcinomi a livello ano-genitale, ma anche nella cavità orale e vie respiratorie (DNA integrato)

10 Tipo di lesioni Genotipi di HPV
Lesioni cutanee Verruche volgari, piane e palmari ,2,3,4,7,10,27,28,29,40 Verruche in soggetti con EV ,8,9,12,14,15,17,19,20,47,49 Carcinomi cutanei in soggetti con EV ,8,14,17,20,47 (in rari soggetti geneticamente predisposti) Lesioni mucose Condilomi acuminati ,11, 42,43, 44, 54,55 Papulosi Bowenoide Condiloma gigante ,11 Papillomi delle vie respiratorie ,11 Papillomi congiuntivali ,11 Lesioni della mucosa orale iperplasia focale epiteliale ,32 infezione con HPV del tratto genitale ,11,16 lesioni sulle labbra Carcinoma della cervice uterina alta associazione ,18,45, 56 moderata associazione ,33,35,51,52 scarsa associazione ,11,42,43,44 Cancro vulvare

11 Verruca piana

12 Condilomi acuminati

13 Una risposta immune efficiente è importante per la risoluzione dell’infezione da HPV (tessuto linfoide associato alla cute e mucose) Le malattie associate ad HPV sono frequenti e severe in pazienti con immunodeficienze primarie e secondarie, con disordini linfoproliferativi e AIDS Infiltrati linfo-monocitici sono presenti nelle lesioni in guarigione e i linfociti T infiltranti proliferano in risposta a E7 e L1 La regressione di una lesione è generalmente seguita dalla regressione delle altre

14 mRNA di HPV è espresso nelle lesioni tumorali
HPV e tumori Nel 85-90% di tutti i tumori della cervice uterina è presente DNA di uno dei genotipi di HPV a medio-alto rischio e in circa il 70% è presente il genotipo 16 o 18 HPV a medio-alto rischio è presente nelle lesioni pre-cancerose e nelle lesioni neoplastiche intraepiteliali (CIN). mRNA di HPV è espresso nelle lesioni tumorali Evidenze sierologiche indicano una prevalenza di anticorpi anti-HPV-16 e –18 nei pazienti con tumore cervicale rispetto ai controlli Evidenze simili esistono per l’associazione di HPV e alcuni tumori a cellule squamose vaginali, vulvari, penili e anali

15 Carcinomi della cervice uterina

16 Lesione intra-epiteliale squamosa della cervice (Low-grade)
IP HPV capsid H&E IP HPV capsid H&E

17 Prevalenza delle infezione genitali da HPV e di malattie associate ad HPV in donne (USA)

18 Il carcinoma cervicale correla con il numero di partners sessuali

19 Associazione di HPV con la progressione del carcinoma cervicale
LSIL, low-grade squamous intraepithelial lesion HSIL, high-grade squamous intraepithelial lesion

20 HPV ALTO RISCHIO: 16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/66/68
HPV BASSO RISCHIO: 6/11/40/42/43/44/54/61/72

21 Oncoproteine di HPV Nelle lesioni maligne il DNA di HPV è integrato a livello del gene E2 L’interruzione di E2 potrebbe svolgere un ruolo nella patogenesi neoplastica in quanto normalmente “down-regola” espressione di E6 e E7 Le proteine E5, E6, E7 di HPV inducono la proliferazione cellulare (immortalizzazione) e favoriscono la probabilità di trasformazione neoplastica delle cellule infettate

22 Funzioni di E6 (HPV alto rischio)
Immortalizzazione cellulare Degradazione p53 Inibizione apoptosi Destabilizzazione cromosomica Attivazione telomerasi Blocco funzioni interferone (?)

23 Bersagli cellulari di HPV E6

24 HPV E6 Inattiva p53 - + Radiazioni UV Agenti citotossici Mutageni
virus Danno del DNA p53 p21 Cyclin E cdk 2 mdm2 HPV E6 (alto-rischio) Apoptosi bax bcl-2 PCNA DNA polymerase d - + Cyclin A cdk 2, 4,5,6 Cyclins D1, D2, D3 PCNA p15 p16 p18 HPV E6 Inattiva p53 G2

25 HPV E6 induce la degradazione di p53
Ub AMP ATP E2 E1Ub E1 E2Ub p53 p53 E6 AP E3 p53 E6 AP E6 AP p53 E3 E6 PROTEASOMA

26 Funzioni di E7 (HPV alto rischio)
Immortalizzazione cellulare Inattivazione Rb Attivazione cycline E e A Induzione apoptosi Inhibizione degli inibitori delle kinasi ciclino-dipendenti Degradazione di tirosin-chinasi Blk (?)

27 Bersagli cellulari di HPV E7

28 + HPV E7 inattiva Rb E7 E7 pRB E2F-1 pRB E2F-1 E2F-1 G1 ppRB M S ppRB
Complesso inattivo pRB Repressione trascrizionale E2F-1 E2F-1 G1 Attivazione trascrizionale PPasi cdk ppRB M S ppRB inattiva inattiva G2 ppRB inattiva

29 Cyclin E-cdk 2 Cyclin H-cdk 7
HPV E7 e ciclo cellulare M G1 G2 S Rb pRb Cyclin A-cdk 1 Cyclin B-cdk 1 Cyclins D, D2, D cdks 2,4,5,6 Cyclin E-cdk 2 Cyclin H-cdk 7 Cyclin A-cdk 2 Cyclin E-cdk 2 HPV E7 ? PCNA HPV E7 high-risk p53 p21 E2F Cyclin-cdk Trascrizione P p15, p16 p18, p27 +

30 HPV E5 si inserisce nella membrana cellulare
e attiva il recettore PDGF in assenza del ligando specifico innescando segnali di proliferazione cellulare

31 The major differences between high-risk HPV E6 and E7 proteins and their low-risk counterparts are their abilities to bind to the tumor suppressor proteins p53 and Rb. A number of additional interactions have been reported for the high-risk E6 and E7 proteins. The functions of E6 and E7, independent of their abilities to inactivate p53 and Rb that are required for stable episomal maintenance, remain to be determined. The observation that HPV31 genomes containing E6 mutations unable to degrade p53 and an E7 mutation with reduced Rb binding provides a model to explore the activities of E6 and E7 necessary for genome replication that are shared among all HPVs. Because the complete viral replication program requires a differentiated environment, it will be interesting to conduct future experiments using organotypic models to further analyze the balance between E6 and E7 functions permissive for viral DNA replication in differentiating keratinocytes.

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35 Conclusions The molecular pathogenesis of cancer caused by high-risk HPV infections is presently not fully understood However, high-risk HPVs are self-sufficient to induce malignant conversion Induction of chromosomal instability, mutations, and aneuploidy in noncommitted proliferating cells plays a major role in tumorigenesis Interruption of two independent signaling cascades, i.e., TP53 and RB, is responsible for cellular immortalization and invasive phemotype

36 Vaccino Profilassi delle infezioni VLP ottenute a partire da VP1
Merck (tetravalente HPV 6, 11, 16, 18): GARDASIL GSK (bivalente HPV16, 18): CERVARIX

37 HPV (alto rischio) e Patogenesi carcinoma cervicale
Fattori mutageni Derivati estrogeni Instabilità genomica per aumentata espressione dei geni virali Aumentata espressione e replicazione DNA virale Infezione Persistenza DNA virale Modificazioni di geni cellulari Integrazione genoma virale Mutazioni geni cellulari Lesione intraepiteliale squamosa (low-grade) Lesione intraepiteliale squamosa (high grade) subclinica Carcinoma invasivo metastasi

38 Gardasil (MERK) Gardasil è un vaccino quadrivalente ricombinante non infettante preparato da particelle simili al virus ( VLPs ) dalla proteina capsidica maggiore L1 del papillomavirus umano ( HPV ) tipi 6, 11, 16 e 18 altamente purificate. Le VLPs non contengono DNA virale, non possono infettare le cellule, riprodursi o causare malattia. L’HPV infetta soltanto l’uomo, ma gli studi sugli animali con papillomavirus analoghi suggeriscono che l’efficacia dei vaccini L1 VLP sia mediata dallo sviluppo di una risposta immune di tipo umorale. Indicazioni terapeutiche - Gardasil è un vaccino per la prevenzione della displasia di alto grado del collo dell’utero ( CIN 2/3 ), del carcinoma del collo dell’utero, delle lesioni displastiche di alto grado della vulva ( VIN 2/3 ) e delle lesioni genitali esterne ( condilomi acuminati ) causate dal Papillomavirus Umano ( HPV ) tipi 6, 11, 16 e 18. L’indicazione è basata sulla dimostrazione di efficacia di Gardasil in donne adulte di età compresa tra 16 e 26 anni e sulla dimostrazione dell’immunogenicità di Gardasil in bambini ed adolescenti di età compresa tra 9 e 15 anni. L’efficacia protettiva non è stata valutata nei maschi. Approvato da EMEA/FDA

39 Cervarix (Glaxo Smith Kline)
Cervarix è un vaccino bivalente contenente proteine L1 purificate per due tipi del papillomavirus umano ( HPV, tipo 16 e 18 ). Cervarix trova indicazione nella protezione contro la neoplasia intraepiteliale cervicale di alto grado ( detta CIN, una abnorme crescita cellulare precancerosa all’interno della cervice uterina ) ed il cancro cervicale ( detto anche, tumore del collo dell’utero ), causati dall’HPV, sierotipo 16 e 18. Approvato da EMEA, non ancora da FDA

40 Diagnosi di Laboratorio di “Human Papilloma Virus” (HPV)

41 Campioni clinici HPV Frammento bioptico incluso in paraffina
Tampone regione ano/genitale Tampone cervicale Tampone altro tipo

42 Diagnosi di infezione da HPV
Esame Clinico e colposcopia Esame citologico ed istologico Immunocitochimica Microscopia elettronica Sierologia Ricerca acidi nucleici

43 Ibridazione diretta del DNA virale con sonde specifiche
Southern Blot Ibridazione in situ (ISH) Ibridazione in soluzione Amplificazione di sequenze target del genoma virale PCR Sequenziamento

44 Southern blot Tecnica laboriosa: Estrazione DNA, purificazione, taglio con enzimi restrizione, elettroforesi, trasferimento su filtro, denaturazione, ibridazione, rilevazione con SONDE marcate. Standardizzazione difficile: necessita personale qualificato e strutture idonee. Alta sensibiltà con sonde radioattive.

45 Ibridazione in situ (ISH)
Rivelazione di sequenze specifiche di acidi nucleici (DNA e/o RNA) in cellule e tessuti (morfologicamente conservati) mediante l’impiego di sonde geniche marcate con traccianti di diversa natura. Tecnica efficace e di rapida esecuzione ma limitata nell’utilizzo a causa della bassa sensibilità rispetto alle tecniche che utilizzano metodi di amplificazione del segnale o del DNA target. Kit commerciali per diagnostica routinaria di HPV.

46 INFORM® HPV test Metodica di ISH che permette di discriminare HPV ad alto/basso rischio con sonde specifiche mediante reazione colorimetrica o lettura in fluorescenza direttamente su vetrino di preparazione istologica o citologica.

47 INFORM® HPV test Vantaggi: sistema automatizzato, permette di associare direttamente la rilevazione del virus con i cambiamenti nella morfologia di cellule e tessuti, contribuendo a fornire un’immagine chiara della patologia in atto. Limiti: sensibilità inferiore rispetto alle metodiche di amplificazione del target o del segnale. Non permette una genotipizzazione virale, ma discerne solamente tra HPV ad alto/basso rischio. Richiede personale qualificato nella preparazione del campione.

48 Ibridazione in soluzione
Test in vitro che rileva la presenza di acidi nucleici virali grazie al legame diretto di una sonda a singolo filamento. Riconoscimento dell’ibrido genoma virale-sonda da parte di numerosi anticorpi specifici marcati, in grado di dare un segnale amplificato rilevabile da parte di appositi strumenti senza che sia necessaria un’amplificazione di sequenze.

49 Digene HC2 Hybrid Capture® System
1 2 3 Estrazione DNA virale Legame DNA con sonda a RNA specifica Legame DNA-RNA sonda a fase solida mediante Ac 4 5 Legame di DNA-RNA con Ac coniugati a fosfatasi alcalina Emissione di luce misurata con luminometro in Unità di Luce Relativa (RLU)

50 Digene HC2 Hybrid Capture® System
Vantaggi: Test di elevata sensibilità (1 pg target/ml), veloce esecuzione, minimi rischi di contaminazione dovuti ad assenza di amplificazione del segnale, altamente standardizzabile, unico test per rilevazione di HPV approvato dalla Food and Drug Administration. Limiti: Identificazione solo di HPV ad alto/basso rischio, NO genotipizzazione, possibili falsi positivi per cross-reazione, costi più elevati rispetto ad equivalenti metodiche PCR.

51 Amplificazione del Target
 PCR  PCR con ibridazione di sonda  PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)  PCR Quantitativa  Sequenziamento

52 PCR PCR standard: utilizzo di primer universali in grado di amplificare sequenze conservate all’interno del genoma di HPV (L1) oppure di oligonucleotidi specifici per la rivelazione di un particolare tipo virale (E6/E7). PCR nested: prima amplificazione con primer consensus, seconda con primer complementari alla sequenza target amplificata. Vantaggi: rapida, economica, molto sensibile Svantaggi: non approvata FDA, personale esperto, possibilità di contaminazioni. Vantaggi: altamente sensibile Svantaggi: laboriosa, rischio contaminazioni più elevato

53 PCR

54 PCR con ibridazione di sonda
Ibridazione su filtro con sonda marcata di frammenti amplificati mediante PCR standard con primer consensus. Vantaggi: Altissima sensibiltà anche in presenza di bassa carica virale Svantaggi: Laboriosa, necessità di strutture idonee, non discrimina tra i diversi genotipi.

55 PCR-RFLP PCR standard seguita da digestione del prodotto amplificato tramite enzimi di restrizione. Primers consensus costruiti su regioni conservate che amplifichino un frammento contenente porzioni variabili del genoma virale. Vantaggi: economica, molto sensibile, permette una tipizzazione di diversi tipi virali a rischio. Svantaggi: più laboriosa di una PCR standard, necessita di personale esperto nell’interpretazione dei profili elettroforetici, possibili contaminazioni.

56 PCR-RFLP

57 PCR QUANTITATIVA (Taq Man)
Quantificazione della carica virale mediante analisi di fluorescenza emessa da sonde marcate. Vantaggi: Altissima sensibilità (limite teorico di 1 copia di genoma virale), alta specificità, non necessita di corsa elettroforetica, basso rischio contaminazione, rapida esecuzione; diversi lavori sperimentali riconoscono ruolo della carica virale nella patogenesi. Svantaggi: Metodica non ancora standardizzata nella routine diagnostica di HPV, costi elevati, necessita di personale esperto nella messa a punto e nella validazione dei risultati.

58 SEQUENZIAMENTO Metodica di riferimento per il riconoscimento e la genotipizzazione di acidi nucleici virali. L’identificazione avviene mediante la comparazione della sequenza ottenuta con quelle presenti in database pubblici e/o privati. Vantaggi: Massima specificità e sensibilità nella diagnosi, possibilità di genotipizzazione e riconoscimento di tipi virali a rischio particolarmente elevato e identificazione di nuovi tipi. Svantaggi: Costi elevati, metodica laboriosa, personale esperto nell’interpretazione dei cromatogrammi

59 SEQUENZIAMENTO

60 HPV DNA testing Approaches Advantage Disadvantage
Suthern blot high sensitivity time-consuming Dot blot high sensitivity old fashioned (radioactive probes) Hybrid capture high sensitivity low specificity DNA assay (HC I) (non radioactive probes) use of tubes Hybrid capture detects 18 HPV types low specificity DNA assay (HC II) (microtiter plates) (better than HC I) In situ hybridization practical to use low sensitivity (non radioactive probes) PCR high specificity and high risk of sensitivity sample contamination