WESTERN BLOT VANTAGGI: le proteine sono più accessibili;

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1 WESTERN BLOT VANTAGGI: le proteine sono più accessibili;
non c’è perdita di risoluzione se il trasferimento delle proteine viene eseguito correttamente; durata e stabilità delle membrane; una volta trasferite le proteine possono essere conservate per mesi; - il western blot può essere analizzato diverse volte

2 WESTERN BLOT La procedura può essere suddivisa in 3 passaggi:
1. separazione elettroforetica dei polipeptidi 2. trasferimento di tutte le proteine su una membrana appropriata 3. visualizzazione delle proteine di interesse

3 SEPARAZIONE DEI PEPTIDI
una miscela di proteine può essere risolta mediante svariate tecniche elettroforetiche (gel non-denaturante, gel contenente SDS, gel per isoelettrofocalizzazione…) GEL DI POLIACRILAMIDE si ottiene dalla copolimerizzazione di acrilamide con N,N’- metilenbisacrilamide in presenza di un catalizzatore e di un iniziatore la porosità del gel dipende dalla concentrazione di acrilamide e bisacrilamide le proteine vengono separate sulla base delle loro dimensioni, in quanto la presenza di SDS conferisce a tutte le molecole la stessa carica

4 CELLA PER ELETTROFORESI VERTICALE SU GEL

5 TRASFERIMENTO SU MEMBRANA
Per trasferire proteine dalla matrice del gel sono state utilizzate tre procedure 1. diffusione per contatto 2. capillarità o blotting per convezione 3. blotting elettroforetico

6 GENERALE: si ottiene utilizzando coloranti quali Comassie Blue,
VISUALIZZAZIONE GENERALE: si ottiene utilizzando coloranti quali Comassie Blue, Ponceau Red, India ink, fast green e Aurodye Ponceau e fast green sono i più facilmente lavabili, quindi non interferiscono con eventuali detection specifiche SPECIFICA: si ottiene utilizzando sonde con isotopi radioattivi o mediante anticorpi specifici

7 METODI USATI PER LA VISUALIZZAZIONE SPECIFICA