Metodi di sequenziamento

Presentazione sul tema: "Metodi di sequenziamento"— Transcript della presentazione:

1 Metodi di sequenziamento
Sanger (enzimatico) Maxam e Gilbert (chimico)

2 Confronto metodi di sequenziamento
Sanger rapida e semplice attuazione disponibilità di kit necessità di primer sensibile a strutture secondarie Maxam e Gilbert lunga preparazione del DNA reazioni da mettere a punto relativamente economico strutture non influenti utilizzabile per oligonucleotidi

3 Gel di poliacrilammide di sequenza

4 Sequenziamento automatico

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6 Sequenziamento con Taq polimerasi

7 Agarosio o acrilammide
BLOTTING (TRASFERIMENTO) Molecole trasferite Sonda Gel Southern DNA DNA o RNA Agarosio o acrilammide Northern RNA Western Proteine Anticorpi Acrilammide

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9 Assemblaggio del blot capillare
vaschetta carta 3MM carta 3MM } membrana nylon gel supporto tampone

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11 Fattori che influenzano l’ibridazione
Temperatura Forza ionica pH

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14 Assemblaggio dell’elettroblot
membrana nylon carta 3MM gel spugnette - + tampone

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16 B. LEWIN, IL GENE - Edizione compatta, Zanichelli Editore S. p. A
B. LEWIN, IL GENE - Edizione compatta, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2007

17 Analisi di espressione genica

18 Analisi di espressione con Northern blot

19 Altre tecniche di analisi
Estensione del primer (primer extension) Protezione dalla S1/RNasi (mapping) RT-PCR (real time QRT-PCR)

20 Estensione del primer mRNA totale cap mRNA globina 3’ 5’
oligo antisenso marcato ibridazione estensione con RT Analisi dei frammenti estesi su gel di sequenza frammento protetto

21 Protezione da RNasi (RNase Protection)
mRNA totale sonda RNA antisenso mRNA globina cap 5’ 3’ ibridazione trattamento con RNasi Analisi dei frammenti protetti su gel di sequenza frammento protetto inizio trascrizione

22 MICROARRAY DI cDNA

23 Analisi interazioni DNA-proteine: saggio di footprinting

24 Analisi interazioni DNA-proteine:
saggio EMSA

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26 Descrizione generale esercitazioni di laboratorio
Studio della localizzazione intracellulare della proteina SEC4 del lievito Saccaromyces cerevisiae Clonaggio di SEC4 in vettore per l'espressione in lievito di proteine di fusione con "tag" (GFP) Espressione di SEC4 in lievito e analisi della sua localizzazione mediante western blot di estratti frazionati Parte A I) 1. PCR su DNA genomico (preparazione frammento da clonare) 2. Preparazione di DNA plasmidico (vettore di clonaggio) con colonnina 3. Digestione DNA (vettore e frammento) con enzimi di restrizione II) 1. Reazione con enzima "ligasi" 2. Analisi su gel di agarosio 3. Analisi spettrofotometrica del DNA preparato 4. Trasformazione batterica 5. Preparazione piastre di agar III) 1. Analisi risultati trasformazione 2. Minipreparazione DNA plasmidico 3. Analisi su gel di agarosio

27 PCR da DNA genomico EcoRI BamHI BamHI EcoRI Sec 4

28 Clonaggio con doppia digestione
BamHI EcoRI EcoRI BamHI  GAATTC CTTAAG  AAGCTT TTCGAA BamHI EcoRI Sec 4  AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG  G CTTAA AGCTT A DNA ligasi pUG34

29 Reazione di ligasi strategie controlli

30 Controlli nella ligasi
 AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG  G CTTAA AGCTT A DNA ligasi Sec 4 pUG34  G CTTAA AGCTT A ? DNA ligasi pUG34

31 Visualizzazione del DNA

32 DNA superavvolto negativamente DNA circolare con superavvolgimento = 0

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34 PCR da genomico PCR da plasmide Marcatore 200 ng PCR da genomico PCR da plasmide DNA genomico Vettore pUG34 DNA genomico Vettore pUG34

35 Sistemi di espressione
In vitro (estratti cellulari) In vivo (cellule in coltura) Animali transgenici

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37 Gene reporter

38 I confini di un promotore possono essere determinati
mediante analisi di delezioni progressive attività 100 reporter reporter 100 reporter 100 reporter 100 reporter 30 reporter B. LEWIN, IL GENE - Edizione compatta, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2007

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41 Metodi di trasfezione fosfato di calcio liposomi (e simili)
elettroporazione infezione (SV40, retrovirus) B. LEWIN, IL GENE - Edizione compatta, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2007

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43 Trasfezione in cellule in coltura
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44 Vettori episomali B. LEWIN, IL GENE - Edizione compatta, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2007

45 Trasfezione di cellule in coltura
transiente stabile vettori episomali

46 Vettori di clonaggio per lievito

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