BASI MOLECOLARI DELL’AZIONE DEL FARMACO BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 5 CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi.

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1 BASI MOLECOLARI DELL’AZIONE DEL FARMACO BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 5 CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi http://users.unimi.it/mpl/lezioni.html

2 ChIP-on-chip (o ChIP-chip) è una tecnica che combina la immunoprecipitazione di cromatina (chromatin immunoprecipitation "ChIP” con la tecnologia del micro array(microarray technology “chip").chromatin immunoprecipitationmicroarray technology

3 Chip-on-chip analysis per lo studio delle interazioni DNA proteine

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5 read-out Normalizzazione dei dati e analisi esplorativa dei dati “estrazione delle informazioni” Sito DNA arricchimento proteina di interesse

6 Le prime analisi si sono focalizzate sulle differenze tra animali in Proestro e Metestro, per vedere se la differenza dei livelli di Estradiolo circolante avesse degli effetti sull’espressione genica. Come atteso, gli animali LID non mostrano nessuna significativa differenza nell’espressione genica nelle due fasi del ciclo, come se quest’ultimo fosse appiattito. Gli animali WT, al contrario, mostrano deboli ma rilevabili differenze nelle due fasi; tuttavia, il quadro osservato e’ totalmente inatteso, in quanto i geni differenzialmente espressi sono tutti geni MAGGIORMENTE espressi nella fase di metestro o, guardando all’inverso, downregolati nella fase di Proestro. Considerando cio’ che abbiamo sempre osservato, vale a dire un’attivazione del recettore degli estrogeni in fase di proestro, questo stupisce. WT M vs WT PWT P vs WT M Downregulated in P Upregulated in M SEM Analysis

7 GO Term Analysis Una volta identificati i trascritti differenzialmente espressi nei due gruppi (t test & SAM analysis, tenendo in considerazione solo quelli con Fold Indution >=1,5), si cerca di capire se questi geni sono implicati in determinati ‘Biological Process’ o hanno particolari ‘Molecular Function’ o interferiscono in un determinato ‘Pathway’. Questa analisi si puo’ fare a diversi “livelli”, i risultati riportati si riferiscono ad un livello piuttosto superficiale, ma per questo piu’ generale e credo indicativo. Riporto: - BP = Biological Process - MF = Molecular Function - Pathway L’analisi e’ stata fatta principalmente con http://david.abcc.ncifcrf.gov/summary.jsp piu’ molti altri software e websites (le risorse sono infinite)

8 I geni per ogni categoria sono nel file Excel ‘Panther_BP_WTall_vs_LIDAll.xls’ Biological Process - WTall vs LIDall Considerando tutti i trascritti differentemente espressi, sia upregolati che downregolati.

9 Molecular Function - WTall vs LIDall I geni per ogni categoria sono nel file Excel ‘Panther_MF_WTAll_vs_LIDAll.xls’

10 I LIMITI DELLA ANALISI GENOMICA: RIPRODUCIBILITA’ ANALISI NON QUANTITATIVA I mRNA NON RIFLETTONO ESATTAMENTE LE PROTEINE PRESENTI NELLA CELLULA

11 proteomica Il fine della proteomica consiste nella completa identificazione delle proteine e della loro espressione in determinati cellule o tessuti La metodologia su cui si basa la proteomica comprende: gel elettroforesi bidimensionale; HPLC e spettrometria di massa

12 (20,000 to 25,000 genes vs. > 500,000 proteins). E’ stato calcolato che il corpo umano puo’ esprimere fino a 2 milioni di proteine, ciascuna con differenti funzioni

13 I metodi della proteomica dagli anni ‘70: gel elettroforesi bidimensionale Limiti di definizione e riproducibilità Anni ’90 spettrometria di massa con metodi di ionizzazione alternativi (electrospray o MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionization ) Non si amplificano le proteine: dimensione campioni Identificazione dei peptidi da miscele complesse Rapidità Analisi quantitativa Limiti nelle conoscenze di genomi da diversi organismi Disponibilità di strumentazione

14 electrospray ionization liquid chromatography mass spectrometry

15 John Bennett FennJohn Bennett Fenn ha ricevuto il premio Nobel per la chimica nel 2002 per lo sviluppo della tecnica di elettrospray per l’analisi di macromolecole biologiche

16 Stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) per analisi proteomica quantitativa

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18 Mann Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 952–958 (December 2006) | doi:10.1038/nrm2067 Functional and quantitative proteomics using SILAC SILAC (Stable isotope labelling with amino acids in cell culture)

19 Proteomica e trascrittomica a confronto Uno studio in cui si sono comparati i dati di analisi di cellule MCF-7 Su un totale di 7278 geni identificati in modo univoco come messaggi o proteine 55% provengono da analisi proteomica 77% provengono da microarray

20 LE PROSPETTIVE DELLA PROTEOMICA: continuo progresso della tecnologia per misure sempre più su larga scala e rapide costruzione di banche dati protomica interviene in cellule dove mRNA non è informativo (es cellule ematiche) La misura proteomica fornisce l’end point, il microarray va verificato con qPCR e da western La proteomica permette di studiare la presenza di modificazioni post-traduzionali, di interazioni proteina-proteina

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22 INTERATTOMICA analisi del trascrittoma, del proteoma e dell’interattoma comparati per arrivare a definire le funzioni fisiologiche di ciascun gene

23 L’INTERATTOMA O BIOLOGIA DEI SISTEMI (system biology)

24 Per grafico intendiamo un insieme di punti, nodi o vertici che sono tra loro collegati non in modo unidirezionale. Nel digrafico la direzionalità o bidirezionalità dell’evento è segnata L’interattoma rappresenta interazioni molecolari con un sistema digrafico

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26 Gene Ontology http://www.geneontology.org/index.shtml Un progetto atto a costruire un vocabolario per descrivere geni e prodotti genici attribuibili a ogni organismo Questo vocabolario serve per dare un unico nome a un specifico prodotto in modo che questi così compaia nelle diverse banche dati e possa venire rapidamente ritrovato

27 L'ontologia, una delle branche fondamentali della filosofia, è lo studio dell'essere in quanto tale, nonché delle sue categorie fondamentali. filosofiaesserecategorie Il termine deriva dal greco ὄντος, òntos (genitivo singolare del participio presente ὤν di εἶναι, èinai, il verbo essere) più λόγος, lògos, letteralmente "discorso sull'essere”lògos

28 Potenziamento dell'interoperabilità delle banche dati biologiche mediante la standardizzazione della terminologia biochimica e l'introduzione di un'ontologia condivisa Combinazione dei diversi punti di forza di gruppi europei attivi in vari ambiti della normalizzazione per la terminologia biochimica all'interno delle banche dati, allo scopo di sviluppare e applicare un vocabolario controllato e un'ontologia comune per la descrizione degli attributi biologici nelle banche dati biologiche Gene Ontology

29 Gene Ontology http://www.geneontology.org/index.shtml http://www.geneontology.org/index.shtml Ogni gene/proteina si contraddistingue per un numero identificativo unico (GO:nnnnnnn) e un nome (es: cellula, fibroblasto, fattore di crescita, trasduttore del segnale). Ogni termine viene assegnato a una delle tre suddivisioni della banca (ontology): 1.Funzioni molecolari 2.Componenti cellulari 3.Componenti I processi biologici

30 Gene Ontology (GO, ontologia genica): un vocabolario controllato e strutturato per la descrizione di prodotti genici in termini di funzione molecolare, di ruolo biologico e di ubicazione cellulare

31 A gene product might be associated with or located in one or more cellular components; it is active in one or more biological processes, during which it performs one or more molecular functions. For example, the gene product cytochrome C can be described by: the molecular function term oxidoreductase activity, the biological process terms oxidative phosphorylation and induction of cell death, and the cellular component terms mitochondrial matrix and mitochondrial inner membrane.

32 Topology The ontologies are structured as directed acyclic graphs, which are similar to hierarchies but differ in that a more specialized term (child) can be related to more than one less specialized term (parent). For example, the biological process term: hexose biosynthetic process has two parents, hexose metabolic process and monosaccharide biosynthetic process. This is because biosynthetic process is a type of metabolic process and a hexose is a type of monosaccharide. When any gene involved in hexose biosynthetic process is annotated to this term, it is automatically annotated to both hexose metabolic process and monosaccharide biosynthetic process.

33 ‘OMICS APPLICAZIONI MEDICHE Informazioni sulla malattia Farmacogenetica Test genetici Terapia genica

34 Farmacogenetica nella ricerca e sviluppo di nuovi farmaci Farmacogenetica: lo studio di variazioni genetiche e del loro effetto nella risposta a farmaci

35 Scoperta e sviluppo di nuovi farmaci

36 Studi genetici per la identificazione di nuovi bersagli terapeutici Inizi anni ‘80 si cercano polimorfismi associati alla manifestazione di Alzheimer Anni ‘90 ApoE appare associato a apparizione precoce di AD (60 anni negli omozigoti); In soggetti con ApoE2/3 la malattia generalmente appare dopo I 90 anni Dati confermati da genome-wide association studiesdove si studiano più di 500.000 SNP per volta

37 A. Roses, NDD 2008 Traslocasi della membrana mitocondriale esterna

38 Studi genetici per lo studio dell’efficacia di un trattamento farmacologico

39 ROSIGLITAZONE IN PAZIENTI CON ALZHEIMER PORTATORI E NON DEL GENE APOE4

40 Studi genetici per l’ identificazione di pazienti a rischio di manifestare effetti collaterali specifici in seguito a trattamenti farmacologici

41 1.CYP2C9 e metabolismo di warfarina 2.Pazienti con AIDS che sviluppano una sindrome da ipersensibilità a trattamento con abacavir

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43 Farmacovigilanza