Colture cellulari.

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1 Colture cellulari

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3 Sistemi di Crescita ADESIONE: cellule di origine nervosa, epiteliale o mesenchimale (che in vivo fanno parte di tessuti solidi) Fenomeno che richiede l’interazione di recettori di membrana con proteine adesive, adsorbite sulla superficie della piastra di coltura SOSPENSIONE: cellule di origine ematopoietica (che normalmente vivono in un mezzo fluido)

4 Suspension cultures Adherent cultures

5 a. Mechanical b. Proteolytic enzymes: tripsina, collagnasi, tripsina-EDTA c. EDTA

6 Colture di cellule aderenti
Le cellule aderenti crescono fino ad occupare l’intera superficie disponibile: a questo stadio si dicono confluenti: la crescita si arresta e le cellule devono essere staccate e trasferite in nuove piastre. 1. Per il trasferimento si ricorre all’uso di EDTA (chela Ca2+ e Mg2+, indispensabili per l’adesione) e/o di tripsina (degrada le proteine della matrice); 2. Avvenuto il distacco l’azione dell’EDTA e della tripsina viene neutralizzata dall’aggiunta di nuovo mezzo di coltura che contiene cationi bivalenti in eccesso ed inibitori della tripsina. 3.Le cellule vengono quindi contate e seminate in nuove piastre, oppure si procede per diluizione. Il tempo necessario alle cellule per duplicarsi è di circa ore a seconda del tipo cellulare.

7 Terreni per colture La crescita delle cellule in vitro viene assicurata dalla presenza di elementi nutritivi di base (glucosio, aminoacidi, sali minerali) e fattori di crescita (presenti nel siero) I terreni usati per le colture cellulari (IMEM; DMEM; RPMI, …) differiscono tra loro per il contenuto in amminoacidi e sali, e per la concentrazione di glucosio. La composizione esatta dei singoli terreni ed il tipo di terreno adatto per una data linea cellulare viene di solito specificato dalla ditta produttrice. Per la crescita, le cellule richiedono un valore di pH del mezzo compreso tra 7.2 e 7.4. Per mantenere costante tale valore di pH, si ricorre per lo più ad incubatori con una fase gassosa contenente il 5% di CO2 e terreni contenenti NaHCO3.

8 Plastica per coltura Sono generalmente in polistirene:
materiale rigido con superficie lucida buona resistenza chimica a soluzioni acquose limitata resistenza a solventi totale assenza di tossicità per le cellule in coltura trasparenza che consente una osservazione diretta al microscopio la superficie è trattata chimicamente per renderla idrofila e carica negativamente (per favorire i legami stabili con i fattori di adesione presenti nel siero)

9 L’adesione è un fenomeno attivo che richiede l’interazione dei recettori di membrana, le integrine, con le proteine adesive, quali la fibronectine, adsorbite sulla piastra di coltura.

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11 Linee cellulari particolarmente utilizzate
3T fibroblast (mouse) BHK21 fibroblast (Syrian hamster) HeLa epithelial cell (human) PtK1 epithelial cell (rat) L6 myoblast (rat) PC12 chromaffin cell (derived from a rat pheochromocytoma) COS fibroblast (monkey) CHO ovary (chinese hamster) HEK-293 generated by transformation of embryonic kidney cells (human)

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13 Conservazione delle cellule in azoto liquido
Per la conservazione delle cellule per lunghi periodi si ricorre allo stoccaggio in azoto liquido (-196°C). Il congelamento in azoto liquido mantiene le cellule vive in completa quiescenza per anni. Tramite congelamento, quindi, si può costituire uno stock di cellule che mantengono le caratteristiche fisiologiche e biochimiche delle cellule di partenza. Le cellule prima del congelamento devono essere in fase logaritmica di crescita o devono aver appena raggiunto la confluenza. Il congelamento viene fatto in presenza di terreno di crescita, siero e agenti crioprotettivi (DMSO). La velocità con cui il campione viene congelato è molto importante perché congelamenti troppo rapidi portano alla formazione di cristalli di ghiaccio (troppo grossi) all’interno delle cellule, questi, al momento dello scongelamento, provocano lisi della membrana plasmatica.

14 CONGELAMENTO Il congelamento può essere letale per le cellule in relazione agli effetti dannosi causati dai cristalli di ghiaccio. Per minimizzare questi effetti, si possono prendere diverse precauzioni: utilizzare un agente crioprotettivo in grado di abbassare il punto di congelamento, come il glicerolo o il DMSO Il medium di congelamento, che usualmente viene utilizzato è costituito da 90% siero, 10% DMSO usare cellule in salute che stanno crescendo durante la fase logaritmica e sostituire il medium 24 ore prima del congelamento Le cellule devono essere portate lentamente dalla temperatura ambiente a -80°C, al fine di permettere all’acqua di uscire dalle cellule prima del congelamento. Il tasso ottimale di raffreddamento è 1-3°C per minuto.

15 Per regolare il processo al tasso ottimale di congelamento attraverso una periodica immissione di azoto liquido: camere di congelamento Il Mr. Frosty è un contenitore riempito con 200 ml di isopropanolo a temperatura ambiente e le vials di congelamento contenenti le cellule sono posizionate in un rack posto all’interno del contenitore stesso. Questo posto in un freezer -80°C. Il ruolo dell’isopropanolo è quello di consentire alle vials di raggiungere la temperatura di congelamento lentamente, circa 1°C al minuto. Una volta che il contenitore ha raggiunto -80°C (in 4 ore o più, overnight), le vials devono essere rimosse dal Mr. Frosty e immediatamente poste nel bidone dell’azoto liquido. Le cellule sono stoccate alle temperature dell’azoto liquido, perché lo sviluppo dei cristalli di ghiaccio è ritardata al di sotto dei -130°C.

16 Il congelamento delle cellule è una tecnica utilizzata molto spesso nei laboratori di ricerca. Si tratta di un protocollo semplice ma delicato perché in questi passaggi la sensibilità delle cellule è molto alta. La soluzione di congelamento in cui vengono immerse le cellule è composta da siero bovino con l'aggiunta di un agente crioprotettivo come per esempio il DMSO (dimetilsulfossido) o il glicerolo. La scelta del reagente dipende dal tipo di cellule da congelare. Il glicerolo risulta essere meno tossico del DMSO. Questa miscela riduce la formazione di cristalli di ghiaccio intracellulari ed extracellulari e in tal modo le cellule risentono meno dello shock da scongelamento per cui sono in grado di riprendere le loro attività metaboliche e di crescita. Durante il congelamento, il metabolismo cellulare si ferma quando tutta l'acqua è convertita in ghiaccio. Esistono altri metodi per bloccare il metabolismo cellulare come ad esempio la disidratazione o l'aumento della pressione osmotica. Il congelamento inoltre può avvenire con due diverse velocità: se avviene lentamente si forma poco ghiaccio intracellulare ma si ha un forte sbilanciamento osmotico, questo perchè si ghiaccia prima l'acqua all'esterno della cellula aumentando così la concentrazione di soluto extracellulare. Se il congelamento invece avviene velocemente si ha meno sbilanciamento osmotico ma si forma più ghiaccio intracellulare che può essere dannoso per le cellule. Il congelamento deve mantenere elevata la vitalita' cellulare per tutto il periodo di congelamento. E' molto importante sia la velocita' di congelamento che di scongelamento. Per quanto riguarda il congelamento bisogna ricordare che il congelamento rapido porta alla formazione di cristalli di ghiaccio all'interno della cellula, cristalli che, al momento dello scongelamento, portano alla rottura della membrana plasmatica. Basse velocita' di congelamento portano invece alla deposizione di ghiaccio nell'ambiente extracellulare, a condizione pero' che la concentrazione interna di soluti sia sufficientemente alta da rendere la concentrazione dell'acqua intracellulare minore di quella extracellulare. Questo processo viene di solito controllato aggiungendo al terreno di congelamento un agente crioprotettivo permeabile come il dimetilsolfossido (DMSO) o il glicerolo. Quando poi si formano i cristalli di ghiaccio nel mezzo extracellulare, l'acqua viene sottratta alle cellule perche' la tensione di vapore del ghiaccio e' piu' bassa di quella del citoplasma, prevalentemente acquoso. L'acqua esce dalle cellule finche' le tensioni di vapore sono all'equilibrio.

17 Liquid nitrogen storage tank
Temperature = -196°C

18 Per massimizzare il recupero delle cellule dopo lo scongelamento, le cellule devono essere riscaldate molto rapidamente, posizionando le vials direttamente dall’azoto liquido nel bagnetto riscaldato a 37°C. Non appena l’ultimo cristallo di ghiaccio si è sciolto, le cellule devo essere diluite nel medium di coltura pre-riscaldato.

19 Preparazione delle soluzioni

20 Preparazione del PBS ( Phosphate buffer saline) e delle soluzioni per ELISA indiretto
Volume tot. 500ml NaH2PO4 x H2O P.M g/mol  1,9 mM Na2HPO4 x 7H2O P.M g/mol  8,1 mM NaCl P.M. 58,4 g/mol  0,154 M Questo PBS verra’ utilizzato per fare le seguenti soluzioni: PBS-BSA al 3% (la BSA è una polvere) vol. fin. 25 ml PBS-BSA al 0,5% vol. fin. 50 ml PBS con TWEEN-20 allo 0,05% vol. fin. 430 ml

21 Preparazione del Reagent Diluent dell’ELISA sandwich:
Diluire in acqua il Reagent Diluent 10X in modo da ottenere 50 ml di Reagent Diluent 1X Reagent diluent 10X (Vf = 50 ml): BSA 0,1 % TWEEN 0,05 % Tris saline buffer 20 mM Trizma base (PM 121,14) 150 mM NaCl (PM 58,44) H2O distillata Trovare le quantità di ciascun componente per preparare 50 ml di reagent diluent 10X