Fabrizio Loreni Tel Antonella Ragnini Tel

Presentazione sul tema: "Fabrizio Loreni Tel Antonella Ragnini Tel "— Transcript della presentazione:

1 E-mail loreni@uniroma2.it Antonella Ragnini Tel. 0872 570317
Fabrizio Loreni Tel Antonella Ragnini Tel Wilson K., Walker J.M. (a cura di) Biochimica e Biologia Molecolare - Principi e tecniche nuova edizione italiana a cura di M.S. Pilone e L. Pollegioni Anno/Pagine: pp Euro: 104,00

2 Le lezioni si svolgeranno il mercoledì dalle 11 alle 13 in aula 2 (dall’10 marzo).
Le esercitazioni si svolgeranno il martedì e il mercoledì dalle 14 alle 18 (dal 16 marzo) nel laboratorio al PP1 secondo due turni: A (martedì) e B (mercoledì) Le esercitazioni sono organizzate in gruppi da 3 persone. Valutazione: 2 test in itinere (il primo sarà il 7/4/10) e relazione del laboratorio (vedi linee guida)

3 Acidi nucleici come materiale di studio
DNA endogeno DNA esogeno (transgeni) RNA strutturale mRNA

4 Isolamento DNA da cellule eucariotiche

5 Isolamento acidi nucleici
lisi cellulare purificazione 2a. deproteinizzazione 2b. concentrazione

6 Metodi di lisi cellulare
Tecnica Applicazione Metodi non meccanici Shock osmotico Tessuti animali molli, alcune cellule vegetali Congelamento/scongelamento Tessuti animali molli, alcuni batteri Enzimi litici Cellule animali e vegetali Metodi meccanici Pestello e mortaio Tessuti resistenti Sfere di vetro Batteri e funghi Omogenizzatore a motore Tessuti vegetali e animali Omogenizzatore a mano Tessuti molli delicati Estrusione solida (Hughes press) Materiale vegetale resistente Estrusione liquida (French press) Microorganismi Ultrasonicazione

7 Purificazione acidi nucleici
Deproteinizzazione: agenti enzimatici solventi organici Precipitazione: cationi etanolo (Na, NH4) isopropanolo

8 Purificazione acidi nucleici

9 Purificazione acidi nucleici

10 Isolamento DNA

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12 Isolamento DNA plasmidico
Protocollo “classico” Colonnine cromatografiche (kit commerciali)

13 Protocollo classico Risospensione delle cellule in tampone con RNasi
Lisi cellulare con NaOH/SDS Neutralizzazione con Kacetato (precipitazione di proteine) Estrazione fenolo/cloroformio Precipitazione con isopropanolo Risospensione in TE

14 Isolamento RNA

15 Purificazione mRNA

16 Analisi acidi nucleici
Spettrofotometro (fotometro) Elettroforesi su gel

17 1 OD260=50g/ml OD260/OD280=1,8-2,0 Spettro di assorbimento del DNA
220 240 260 280 300 320 0.5 1.0 1.5 lunghezza d’onda (nm) Assorbanza (OD) 1 OD260=50g/ml OD260/OD280=1,8-2,0

18 Amplificazione DNA Clonaggio PCR

19 Watson et al. , BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S. p
Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

20 Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore (ligasi) Introduzione nella cellula ospite Selezione Minipreparazione di plasmidi per verifica

21 Caratteristiche vettori plasmidici
Origine di replicazione Sito di clonaggio Marcatore di selezione

22 Vettori plasmidici

23 Reazione di ligasi strategie controlli

24 Trattamento del vettore con fosfatasi
 pAATTC G  G CTTAA AATTC G CTTAAp fosfatasi  GpAATTC CTTAA G G AATTC CTTAApG DNA ligasi pAATTC G CTTAAp EcoRI  GAATTC CTTAAG

25 Clonaggio con doppia digestione
EcoRI HindIII  GAATTC CTTAAG  AAGCTT TTCGAA  G CTTAA AGCTT A  AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G A TTCGA EcoRI HindIII  GAATTC CTTAAG  AAGCTT TTCGAA

26 Controllo della reazione di ligasi
Reazione (vettore + inserto) Controllo (vettore) ligasi ligasi trasformazione trasformazione selezione selezione Colonie con vettore ricombinante + Colonie con vettore “vuoto” Colonie con vettore “vuoto”

27 Metodi di trasformazione dei batteri
Metodo del cloruro di calcio Elettroporazione

28 Strategie di selezione nel clonaggio

29 Vettori plasmidici

30 Strategie di selezione nel clonaggio

31 Vettori di espressione

32 Vettore di espressione in cellule di mammifero
EUCARIOTICO

33 Vettori di espressione inducibili

34 Proteine di fusione prom Tag o rep. cDNA term trascrizione traduzione

35 Espressione proteine di fusione

36 PCR (polymerase chain reaction)

37 PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer

38 PCR da DNA genomico

39 PCR da mRNA (RT-PCR)

40 Uso dei “linkers”

41 Vettori dA:dT 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’

42 PCR da DNA genomico EcoRI BamHI BamHI EcoRI

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