METODI DI ANALISI CROMOSOMICA

Presentazione sul tema: "METODI DI ANALISI CROMOSOMICA"— Transcript della presentazione:

1 METODI DI ANALISI CROMOSOMICA
I CROMOSOMI SONO BEN VISIBILI DURANTE LA FASE CENTRALE DELLA DIVISIONE CELLULARE (METAFASE) E' NECESSARIO DISPORRE DI CELLULE CHE SI DIVIDONO: TESSUTI IN ATTIVA PROLIFERAZIONE NEI MAMMIFERI TESSUTI ATTIVAMENTE PROLIFERANTI SONO DIFFICILMENTE ACCESSIBILI (GONADI, MIDOLLO OSSEO, TROFOBLASTO, TUMORI) E' NECESSARIO INDURRE ARTIFICIALMENTE LA DIVISIONE CELLULARE COLTURE IN VITRO GENETICA DI CELLULE SOMATICHE

2 COLTURE IN VITRO DI CELLULE SOMATICHE
N.B.B.: SI SVILUPPANO TECNICHE CHE CONSENTONO DI MANIPOLARE IN VITRO CELLULE DI EUCARIOTI MULTICELLULARI IN ANALOGIA CON QUANTO GIA' SI PUO' FARE CON LE CELLULE BATTERICHE HARRISON COLTURE DI CELLULE DI RANA LEWIS 1911 CARREL 1912 YOUNGNER TECNICHE DI DISSOCIAZIONE PER CELLULE DI MAMMIFERO EARLE TERRENI DI COLTURA, EAGLE FATTORI DI CRESCITA WHITE PER CELLULE DI MAMMIFERRO

3 APPLICAZIONI MORFOLOGIA E FISIOLOGIA DI TESSUTI ED ORGANI
BIOCHIMICA CELLULARE VIROLOGIA (CRESCITA, ISOLAMENTO, TITOLAZIONE DI VIRUS ANIMALI) FARMACOLOGIA IMMUNOLOGIA (ANTICORPI MONOCLONALI) GENETICA (IBRIDI SOMATICI) CITOGENETICA (PATOLOGIA CROMOSOMICA CITOGENETICA ONCOLOGICA)

4 REPLICAZIONE, TRASCRIZIONE, TRADUZIONE
RIPARAZIONE DEL DNA INTERAZIONI VIRUS-OSPITE DIFFERENZIAMENTO CELLULARE TRASFORMAZIONE NEOPLASTICA INGEGNERIA RIPRODUTTIVA CELLULE STAMINALI, COLTURE DI TESSUTI E DI ORGANI MANIPOLAZIONE GENETICA TERAPIA GENICA CLONAZIONE

5 VANTAGGI CONTROLLO AMBIENTE FISICO- CHIMICO
POPOLAZIONI CELLULARI OMOGENEE ESPOSIZIONE DIRETTA A DOSI CONTROLLATE DI SOSTANZE ECONOMIA DI TEMPO E MATERIALE ALTERNATIVA ALLA SPERIMENTAZIONE ANIMALE

6 SVANTAGGI NECESSITA' DI ATTREZZATURE SOFISTICATE (ASEPSI, TEMPERATURA, PRESSIONE, TENSIONE CO2, O2,) LIMITI ALLA QUANTITA'DI CELLULE COLTIVABILI CON SISTEMI NON INDUSTRIALI ( g) INSTABILITA' GENETICA DURANTE LA PROGRESSIONE IN VITRO PRESSIONI SELETTIVE VARIABILI ED INCONTROLLABILI PERDITA DEL DIFFERENZIAMENTO

7 DEFINIZIONI COLTURA PRIMARIA LINEA CELLULARE CEPPO CELLULARE
COLTURA INIZIATA DA CELLULE, TESSUTI, ORGANI, PRESI DIRETTAMENTE DA UN ORGANISMO. SI CONSIDERA UNA COLTURA PRIMARIA FINO AL PRIMO PASSAGGIO (TRIPSINIZZAZIONE). LINEA CELLULARE E’ DERIVATA DA UNA COLTURA PRIMARIA. CEPPO CELLULARE E’ DERIVATO DA UNA COLTURA PRIMARIA O LINEA CELLULARE PER SELEZIONE O CLONAZIONE.

8 EFFICIENZA DI PIASTRAMENTO (PE)
CLONE CELLULARE POPOLAZIONE DI CELLULE DERIVATE DA UNA CELLULA SINGOLA PER MITOSI EFFICIENZA DI PIASTRAMENTO (PE) % DI CELLULE SEMINATE IN GRADO DI FORMARE COLONIE, MISURA DEL GRADO DI AUTONOMIA CELLULARE DENSITA' DI SATURAZIONE NUMERO MASSIMO DI CELLULE CHE SI POSSONO OTTENERE IN UNA PIASTRA/ FIASCA IN CONDIZIONI SPERIMENTALI NOTE INOCULO MINIMO NUMERO MINIMO DI CELLULE CHE SI POSSONO SEMINARE PER OTTENERE CRESCITA CELLULARE IN CONDIZIONI SPERIMENTALI NOTE

9 LABORATORIO DI COLTURE CELLULARI
AMBIENTE STERILE: ASSOLUTA ASEPSI CAPPA A FLUSSO LAMINARE VERTICALE (PREFERIBILMENTE DI SICUREZZA PER LA MANIPOLAZIONE DI MATERIALE CONTAMINATO) TERMOSTATI CON CONTROLLO DI TEMPERATURA, UMIDITA’, TENSIONE DI CO2 E DI O2 MICROSCOPIO ROVESCIATO (OBIETTIVI SOTTO AL PREPARATO) A CONTRASTO DI FASE ATTREZZATURA PER LA CRIOCONSERVAZIONE DELLE CELLULE

10 MATERIALE PER COLTURE CELLULARI
TUTTO IL MATERIALE IN VETRO DEVE ESSERE: LAVATO CON DETERSIVI APPOSITI ATOSSICI E SGRASSATO STERILIZZATO IN STUFA A SECCO CON TEMPERATURE FINO A 300° O IN AUTOCLAVE A 120°-135° IL MATERIALE CHE NON PUO’ SUBIRE TRATTAMENTI AD ALTA TEMPERATURA PUO’ ESSERE STERILIZZATO CON IPOCLORITO DI SODIO QUANDO E’ POSSIBILE E’ PREFERIBILE UTILIZZARE MATERIALE IN PLASTICA MONOUSO

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12 AMBIENTE CELLULARE SUBSTRATO FASE GASSOSA TEMPERATURA TERRENI

13 SUBSTRATO LA MAGGIOR PARTE DELLE CELLULE DI VERTEBRATI CRESCONO ADERENTI AD UN SUPPORTO SOLIDO CELLULE DRIVATE DAL TESSUTO EMATOPOIETICO CRESCONO IN SOSPENSIONE LINEE CELLULARI IMMORTALIZZATE IN VITRO O SPONTANEAMENTE TRASFORMATE POSSONO PERDERE PARZIALMENTE O COMPLETAMENTE LA ADESIVITA’

14 SUBSTRATO IL SUBSTRATO MIGLIORE E’ IL VETRO
LE CELLULE PER ADERIRE AL SUPPORTO HANNO BISOGNO DI UNA SUPERFICIE CARICA LA PLASTICA USA E GETTA DEVE ESSERE PRETRATTATA: POLISTIRENE IDROFILO TRATTATO CON RAGGI  GRANDE VARIABILITA’ DELLA QUALITA’ DEL MATERIALE IN PLASTICA MONOUSO PER ALCUNE COLTURE I CONTENITORI VENGONO SATURATI CON SOSTANZE CHE FAVORISCONO LA CRESCITA

15 FASE GASSOSA TENSIONE DI O2 TENSIONE DI CO2
NELLA MAGGIOR PARTE DEI CASI E’ OTTIMALE LA TENSIONE DI O2 ATMOSFERICA O DI POCO INFERIORE TENSIONE DI CO2 I TERRENI SONO GENERALMENTE TAMPONATI CON CARBONATO H2O + CO H+ + HCO3- NaHCO Na+ + HCO3- LO SCAMBIO DI CO2 TRA FASE LIQUIDA E FASE GASSOSA MANTIENE IL pH DEL TERRENO COSTANTE

16 TEMPERATURA TEMPERATURA OTTIMALE PER CELLULE DI MAMMIFERO:
36.5°C +/- 0.5°C LE CELLULE RESISTONO A LUNGO A BASSE TEMPERATURE: SOPRAVVIVONO BENE SENZA REPLICARSI A 4°C SI CONGELANO IN AZOTO LIQUIDO A - 196°C NON TOLLERANO AUMENTI DI TEMPERATURA SUPERIORI AI 2°C

17 TERRENI pH OTTIMALE 7.4 RANGE 7.0 -7.7
TUTTI I TERRENI CONTENGONO UN INDICATORE DI pH: ROSSO FENOLO 7.4 ROSSO 7.0 ARANCIO 6.5 GIALLO 7.6 VIOLETTO 7.8 VIOLA BASE DI TUTTI I TERRENI E’ UNA SOLUZIONE SALINA BILANCIATA (BSS) ADDIZIONATA CON: AMINOACIDI ESSENZIALI VITAMINE SALI GLUCOSIO COMPONENTI ORGANICI (NUCLEOSIDI, PIRUVATO, LIPIDI)

18 SIERO TUTTE LE COLTURE CELLULARI NECESSITANO DI TERRENO ADDIZIONATO CON SIERO BOVINO NEONATALE BOVINO FETALE DI CAVALLO UMANO TERRENI COMPLETAMENTE DEFINITI: SONO POCO UTILIZZATI SONO EFFICIENTI SOLO IN POCHISSIMI CASI

19 COMPONENTI DEL SIERO PROTEINE: FATTORI DI CRESCITA: ORMONI:
ALBUMINA, FIBRONECTINA, TRANSFERRINA FATTORI DI CRESCITA: FGF, PDGF, EGF, MSA (MOLTIPLICATION STIMULATING ACTIVITY), INSULINE LIKE GROW FACTOR ORMONI: INSULINA, ORMONE DELLA CRESCITA, SOMATOMEDINE, IDROCORTISONE METABOLITI VARI: AMMINOACIDI, CHETOACIDI MINERALI: FERO, ZINCO, RAME, SELENIO  GLOBULINE

20 COLTURE PRIMARIE ESPIANTO PRIMARIO
LE CELLULE MIGRANO A PARTIRE DA UN FRAMMENTO DI TESSUTO DISGREGAZIONE DEL TESSUTO DIPENDE DALL’ABBONDANZA DEL MATERIALE DI PARTENZA: MECCANICA ENZIMATICA

21 REGOLE GENERALI STERILITA’ CHIRURGICA E STERILITA’ IN VITRO NON COINCIDONO IL MATERIALE PRELEVATO PUO’ ESSERE CONSERVATO PER 3-4 gg A 4°C IN TERRENO O SOLUZIONE FISIOLOGICA CONTENETE ANTIBIOTICI VA RIMOSSO TUTTO IL TESSUTO GRASSO O NECROTICO IL FRAMMENTO VA TAGLIATO CON UN BISTURI IL PIU’ FINEMENTE POSSIBILE NELLA COLTURA PRIMARIA LA CONCENTRAZIONE DI CELLULE DEVE ESSERE SEMPRE MOLTO ALTA SI DEVE SCEGLIERE UN TERRENO RICCO CON ALTA CONCENTRAZIONE DI SIERO FETALE SI IMPIANTANO MEGLIO TESSUTI EMBRIONALI

22 CELLULE FIBROBLASTOIDI
CELLULE EPITELIOIDI ALONE DI CRESCITA DA FRAMMENTO A 2 gg DALLA SEMINA COLTURA CONFLUENTE DOPO 7 gg CELLULE FIBROBLASTOIDI COLTURA CONFLUENTE A 10 gg COLTURA CONFLUENTE A 14 gg

23 L’EVOLUZIONE DI UNA COLTURA CELLULARE
TRASFORMAZIONE LINEA CELLULARE CONTINUA log10 NUMERODI CELLULE COLTURA PRIMARIA LINEA CELLULARE ESPIANTO PRIMARIO CRISI I SUBCOLTURA SENESCENZA E MORTE APOPTOSI TEMPO IN COLTURA (generazioni cellulari)

24 UNA COLTURA PRIMARIA SUBISCE FORTI PRESSIONI SELETTIVE CHE NE CONSENTONO L’ADATTAMENTO IN VITRO
UNA COLTURA PRIMARIA E’ ETEROGENEA UNA LINEA CELLULARE E’ OMOGENEA E NON NECESSARIAMENTE UGUALE ALLA COLTURA DA CUI DERIVA SE NON VENGONO USATI ACCORGIMENTI PARTICOLARI CRESCONO CELLULE PARZIALMENTE INDIFFERENZIATE CON MORFOLOGIA FIBROBLASTOIDE (FGF NEL SIERO) SI OSSERVA INSTABILITA’ GENOMICA ED ACCUMULO DI MUTAZIONI

25 MANTENIMENTO DELLA COLTURA
QUANDO LE CELLULE RAGGIUNGONO LA CONFLUENZA VENGONO STACCATE DAL SUPPORTO, CONTATE, RISOSPESE AD UNA DILUIZIONE OPPORTUNA E PIASTRATE IN NUOVI CONTENITORI (CELLULE CHE CRESCONO IN SOSPENSIONE VENGONO SEMPLICEMENTE DILUITE E RISEMINATE) PER STACCARE LE CELLULE SI USA UN ENZIMA PROTEOLITICO: LA TRIPSINA QUESTA OPERAZIONE SI CHIAMA PASSAGGIO IN VITRO VENGONO FATTI CAMBI REGOLARI DI TERRENO

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27 CURVA DI CRESCITA SE LE CELLULE NON VENGONO REOLARMENTE DIVISE SI HA UN DEPERIMENTO DELLA COLTURA ED UN RALLENTAMENTO DELLA CRESCITA: DIMINUISCE L’INDICE MITOTICO, SI ARRIVA ALLA NECROSI log10 NUMERODI CELLULE CRESCITA LOGARITMICA: MASSIMO INDICE MITOTICO TEMPO (ore) tripsinizzazione tripsinizzazione

28 LINEE CELLULARI A VITA DEFINITA SI ESAURISCONO DOPO 20-80 GENERAZIONI
PASSAGIO IN COLTURA OGNI VOLTA CHE LA LINEA VIENE SUBCOLTIVATA SOLO IN ALCUNI CASI COINCIDE CON UNA GENERAZIONE CELLULARE FIBROBLASTI DIPLOIDI SI DIVIDONO 1/1 QUINDI UN PASSAGGIO IN COLTURA COINCIDE CON UN RADDOPPIAMENTO: NUMERO DI PASSAGGI E GENERAZIONI CELLULARI COINCIDONO LINEE CELLULARI A VITA DEFINITA SI ESAURISCONO DOPO GENERAZIONI LINEE CELLULARI IMMORTALIZZATE O TUMORALI CRESCONO INDEFINITAMENTE

29 CLONAGGIO CELLULARE SEMINA DELLE CELLULE AD UNA DENSITA’ CHE PERMETTA LA CRESCITA DI CELLULE SINGOLE PERFETTAMENTE ISOLATE LA DENSITA’ MINIMA CHE CONSENTE LA CRESCITA DI SINGOLE CELLULE E’ MOLTO VARIABILE DA OGNI CELLULA DERIVA UNA POPOLAZIONE DI CELLULE FIGLIE “IL CLONE” GENETICAMENTE IDENTICHE ALLA CELLULA PROGENITRICE (SE NON SONO INTERVENUTE MUTAZIONI) I CLONI CELLULARI POSSONO ESSERE ISOLATI ED AMPLIFICATI CON VARIE PROCEDURE IL CLONAGGIO E’ UN’OPERAZIONE INDISPENSABILE PRIMA DI OGNI ESPERIMENTO, SOPRATTUTTO DI GENETICA, PER ESSERE CERTI DI AVERE UNA POPOLAZIONE CELLULARE OMOGENEA

30 DENSITA’ DI SATURAZIONE
INOCULO MINIMO NUMERO MINIMO DI CELLULE CHE SI POSSONO SEMINARE PER OTTENERE CRESCITA CELLULARE IN CONDIZIONI SPERIMENTALI NOTE DENSITA’ DI SATURAZIONE NUMERO MASSIMO DI CELLULE CHE SI POSSONO OTTENERE IN UNA PIASTRA/ FIASCA IN CONDIZIONI SPERIMENTALI NOTE EFFICIENZA DI PIASTRAMENTO % DI CELLULE SEMINATE IN GRADO DI FORMARE COLONIE, MISURA DEL GRADO DI AUTONOMIA CELLULARE INIBIZIONE DA CONTATTO INIBIZIONE DELLA CRESCITA CELLULARE DOVUTA AI CONTATTI TRA CELLUILE: LA CRESCITA SI ARRESTA QUANDO FORMANO UN MONOSTRATO PIU’ O MENO CONTINUO

31 CELLULE CHE HANNO BASSO INOCULO MINIMO HANNO ALTA DENSITA’ DI SATURAZIONE POSSONO NON AVERE INIBIZIONE DA CONTATTO ED HANNO ALTA EFFICIENZA DI PIASTRAMENTO COLTURE PRIMARIE SONO DELICATE ED ESIGENTI: GENRALMENTE HANNO ALTO INOCULO MINIMO BASSA DENSITA’ DI SATURAZIONE BASSA EFFICIENZA DI PIASTRAMENTO INIBIZIONE DA CONTATTO PER LINEE TUMORALI O IMMORTALIZZATE IN VITRO E’ VERO IL CONTRARIO

32 CURVA DI CRESCITA LE CELLULE VENGONO CONTATE AD INTERVALLI REGOLARI
DEVONO ESSERE CONTATE SOLO LE CELLULE VIVE SI CALCOLA LA VELOCITA’ DI RADDOPPIAMENTO log10 NUMERODI CELLULE OPERATIVAMENTE: SI SEMINANO CLONI E SI CONATA IL NUMERO DI CELLULE PER COLONIA AD INTERVALLI REGOLARI OPPURE SI TRIPSINIZZANO LE CELLULE E SI FA UNA COLORAZIONE VITALE (CON IL COLORANTE TRIPAN BLEU) PLATEAU CRESCITA LOGARITMICA CELLLE HeLa FIBROBLASTI UMANI TEMPO

33 CICLO CELLULARE DURATA DEL CICLO CELLULARE = TEMPO DI RADDOPPIAMENTO
CALCOLO DELLA DURATA DI CIASCUNA FASE DEL CICLO CELLULARE NUMERO DI CELLULE NELLA FASE NUMERO TOTALE DI CELLULE X DURATA DEL CICLO M MITOSI G2 GAP 2 G1 GAP 1 S SINTESI

34 FASE M LE CELLULE IN MITOSI SI RICONOSCONO DALLA MORFOLOGIA INDICE MITOTICO = FRAZIONE DI CELLULE IN MITOSI, E’ UN INDICE DELLA VELOCITA’ DI CRESCITA FAE S LE CELLULE VENGONO ESPOSTE PER BREVE TEMPO IN COLTURA A H3 TIMIDINA, FISSATE, ANALIZZATE PER AUTORADIOGRAFIA SI CONTANO LE CELLULE MARCATE G1 E G2 DOPO SINCRONIZZAZIONE DELLA COLTURA SI CALCOLA LA DURATA DELL’INTERVALLO TRA M ED S E TRA S ED M OPPURE SI USANO CITOFLUORIMETRI A FLUSSO CHE MISURANO IL CONTENUTO DI DNA DELLE CELLULE

35 INTENSITA’ DI FLUORESCENZA
CALCOLO DELLA DURATA DELLE FASI DEL CICLO CELLULARE CON CITOFLUORIMETRI A FLUSSO NUMERO DI CELLULE G1 G2+ M S INTENSITA’ DI FLUORESCENZA CONTENUTO DI DNA

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41 TRASFORMAZIONE CELLULARE: PROPRIETA’ DELLE CELLULE TRASFORMATE
CARATTRISTICHE DI CRESCITA IMMORTALI (CRESCITA INDEFINITA) ANCORAGGIO INDIPENDENTI PERDITA INIBIZIONE DA CONTATTO CRESCITA SU MNOSTRATI CONFLUENTI DI “FOCI” INOCULO MINIMO RIDOTTO ALTA DENSITA’ DI SATURAZIONE LIMITATA RICHIESTA DI SIERO INDIPENDENZA DA FATTORI DI CRESCITA ALTA EFFICIENZA DI PIASTRAMENTO BREVE TEMPO DI RADDIPPIAMENTO

42 CARATTERISTICHE GENETICHE
ALTA FREQUENZA DI MUTAZIONE SPONTANEA ANEUPLOIDIA ETEROPLOIDIA INSTABILITA’ GENOMICA GENERALIZZATA PROPRIETA’ NEOPLASTICHE TUMORIGENE ANGIOGENICHE AUMENTATA SECREZIONE DI PROTEASI INVASIVE

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