Microscopia L'esame microscopico dei microrganismi si basa sull'uso del: Microscopio ottico Microscopio elettronico Microscopio ottico: si usa prevalentemente.

Presentazione sul tema: "Microscopia L'esame microscopico dei microrganismi si basa sull'uso del: Microscopio ottico Microscopio elettronico Microscopio ottico: si usa prevalentemente."— Transcript della presentazione:

1 Microscopia L'esame microscopico dei microrganismi si basa sull'uso del: Microscopio ottico Microscopio elettronico Microscopio ottico: si usa prevalentemente nelle applicazioni di routine Si utilizzano comunemente vari tipi di microscopi ottici: in campo chiaro, in campo scuro, a contrasto di fase e a fluorescenza.

2 Microscopio in campo chiaro

3 Ingrandimento: prodotto degli ingrandimenti rispettivamente degli
obiettivi e degli oculari Valore massimo di ingrandimento: 1500 volte. Risoluzione: capacità di distinguere due punti adiacenti come distinti e separati. E' di 0,2 μm con illuminazione a luce bianca

4 Obiettivi a secco Obiettivi ad immersione (per maggiori ingrandimenti) Olio (di legno di cedro- di vaselina): ha lo stesso indice di rifrazione del vetro.

5 Microscopio a contrasto di fase
Particolarmente utile per lo studio delle cellule viventi Principio:quando i raggi luminosi attraversano un corpo trasparente alcuni di essi vengono ritardati causa della differente densità delle diverse zone dello stesso: il ritardo corrisponde a circa ¼ della lunghezza d'onda (tali raggi si trovano fuori fase rispetto agli altri raggi luminosi) Tali differenze di fase sono trasformate in differenze di intensità luminosa

6 Spirillum volutans Clostridium botulinum Paramecium

7 Microscopio in campo oscuro
Il campione appare luminoso mentre il campo appare oscuro

8 Treponema pallidum Volvox e Spirogyra

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10 Microscopio a fluorescenza
Prevede l'impiego di sostanze fluorescenti che assorbono le onde ultraviolette e le rimettono sotto forma di onde luminose visibili di lunghezza d'onda maggiore I microrganismi trattati con un colorante fluorescente appaiono come corpi colorati e brillanti su di un fondo oscuro

11 Preparati per l'osservazione al microscopio ottico in campo chiaro
1-Osservazione a fresco. Osservazione del microrganismo vitale Si sospende il campione in una goccia di acqua e si osserva fra due vetrini L'osservazione a fresco è preferibile quando: - si osservano i batteri a spirale - si osservano i microrganismi mobili (a goccia pendente su cellula di Koch) Metodo valido per l'osservazione dei microrganismi di maggiori dimensioni come funghi e protozoi

12 2- Osservazione mediante colorazione
Le cellule sono meglio visibili Si può studiare la diversa affinità dei batteri ai vari coloranti Colorante:sale che per idrolisi si scinde in anioni e cationi A- Colorante basico: lo ione colorante porta la carica positiva B- Colorante acido: lo ione colorante porta la carica negativa C- Colorante neutro: sale complesso di un acido colorante con una base colorante Coloranti derivati dall'anilina: A- basici: blu di metilene, violetto di genziana, cristalvioletto, fucsina basica B- acidi: eosina, rosso congo, fucsina acida C- neutri: eosinato blu di metilene La cellula batterica ha affinità per i coloranti basici che si legano ai gruppi fosforici degli acidi nucleici con carica negativa.

13 Mordenzanti: favoriscono l'attecchimento del colore all'interno della
cellula es. acido fenico, soluzione iodo-iodurata (Liquido di Lugol) Differenziatori: sono sostanze decoloranti es. alcool etilico assoluto

14 Allestimento del vetrino
Distensione: del materiale sul vetrino Essiccamento: a temperatura ambiente Fissazione: - rende il materiale aderente al vetrino - rende inalterabili la forma della cellula e degli elementi morfologici - rende la cellula più permeabile ai coloranti Fissazione al calore (120°- 130°C) Fissazione con agenti chimici (es. formaldeide, alcool etilico, ecc.) Colorazione Asciugamento Osservazione microscopica

15 Colorazione semplice Flambaggio Cristalvioletto Distensione Lavaggio
Essiccamento Asciugamento Fissazione Osservazione

16 Colorazione differenziale A- Colorazione di Gram
Mordenzante Decolorante

17 B- colorazione di Ziehl-Neelsen
Serve per evidenziare i Micobatteri i quali sono difficilmente colorabili con gli altri metodi di colorazione a causa delle particolari caratteristiche della parete cellulare ( alto contenuto in lipidi) I Micobatteri sono acido-resistenti