Outline Gene Finding: Struttura ed identificazione di geni in procarioti ed eucarioti; Hidden Markov Models; Genscan; Dept. of Mathematics and Computer.

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1 Outline Gene Finding: Struttura ed identificazione di geni in procarioti ed eucarioti; Hidden Markov Models; Genscan; Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

2 Gene Finding: Premessa
Dimensione del genoma umano: 3 x 109 coppie di nucleotidi Numero di geni ≈ Percentuale di DNA codificante ≈ 1.6% Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

3 Gene Finding: Cosa e’? Data una sequenza di DNA non caratterizzata, trovare: Quali regioni che codificano per proteine Quale dei due filamenti della doppia elica di DNA è codificante Quale schema di lettura è usata in quest’ultimo Dove comincia e dove finisce il gene Dove sono i confini tra esoni/introni negli eucarioti Etc Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

4 Gene Finding: Struttura del gene
Schema di lettura: ogni segmento di DNA ha 6 schemi di lettura Filamento sense: ATGGCTTACGCTTGA Reading frame #3 GGC TTA CGC TTG A.. Reading frame #1 ATG GCT TAC TGC Reading frame #2 TGG CTT ACG GA. TCAAGCGTAAGCCAT Filamento antisense: Reading frame #5 CAA GCG TAA GCC AT. Reading frame #6 AAG CGT CCA T.. Reading frame #4 TCA AGC GTA CAT Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

5 Gene Finding: Organizzazione del gene
Un gene continuo Un gene discontinuo (esoni intervallati da introni) Gene dentro un introne di un altro gene Geni sovrapposti Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

6 Gene Finding: Struttura del gene procariotico
5’ ATGCTACGGATG……..TGA 3’ Regione Regolatrice Promotore Segnale di Start Segnale di Stop Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

7 Gene Finding: Struttura del gene Eucariotico
Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

8 Un ORF è una potenziale regione codificante per proteine.
Gene Finding: ORF (Open Reading Frame) Un ORF o schema di lettura aperto è una zona compresa tra 2 segnali, uno di start e uno di stop presenti nello stesso frame. All’interno dell’ORF non sono presenti ulteriori segnali di Stop. Un ORF è una potenziale regione codificante per proteine. start stop ORF ATG segnali di stop: TAA, TGA e TAG Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

9 Gene Finding: Primo passo
La distanza media tra due segnali di stop in una sequenza casuale di DNA è 64/3 ≈ 21 Una proteina è lunga mediamente 300 aminoacidi Se individuiamo due segnali di stop sufficientemente distanti tra loro potremmo essere in presenza di un potenziale gene Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

10 Gene Finding: ORF in un gene procariotico
Frame 1 Frame 2 Frame 3 ORF ? Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

11 Per ogni frame bisogna:
Gene Finding: Algoritmo Per ogni frame bisogna: Calcolare la distanza tra ogni coppia di segnali di stop consecutivi. Se sono sufficientemente distanti, si va a ricercare il primo codone di start utile. Trovato un ORF di lunghezza sufficiente, è da considerare un potenziale gene. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

12 Frame 1 Frame 2 Frame 3 Gene Finding: ORF in un gene eucariotico
Quali delle finestre che vediamo sono esoni? Quali invece sono assenze casuali di segnali di stop? Frame 1 Frame 2 Frame 3 Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

13 Gene Finding: Procarioti vs Eucarioti
Piccoli genomi 0.5 – 10·106 bp Alta densità basi codificanti (>90%) No introni Identificazione del gene relativamente semplice. Probabilità di successo ~ 99% Eucarioti: Grandi genomi 107 – 1010 bp Bassa densità basi codificanti (<50%) Struttura introni/esoni Identificazione del gene complessa, livello di accuratezza ~ 50% Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

14 Gene Finding: Metodo statistico
Un metodo migliore per determinare regioni codificanti tiene conto delle frequenze dei codoni Un uso diverso dei codoni nella regione codificante è una caratteristica universale dei genomi Uso diseguale degli aminoacidi nelle proteine esistenti Uso diseguale di codoni sinonimi Possiamo usare queste caratteristiche per differenziare regioni codificanti e non codificanti del genoma Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

15 Gene Finding: Segnali di codifica
Distribuzione delle frequenze di coppie di aminoacidi nelle sequenze delle proteine (shewanella). La frequenza media è del 5%. Ogni amminoacido ha delle preferenze nel precedere o seguire un altro amminoacido. Alcuni aminoacidi sono molto più frequenti di altri. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

16 La frequenza delle coppie di aminoacidi dipende dal genoma!!!
Gene Finding: Segnali di codifica La frequenza delle coppie di aminoacidi dipende dal genoma!!! shewanella bovino Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

17 Gene Finding: Segnali di codifica
Le preferenze degli aminoacidi si rispecchiano sulle coppie di codoni (o esanucleotidi) presenti nelle zone codificanti. Ad esempio Nel genoma umano la frequenza della sequenza “AAA AAA” è ~1% nelle regioni codificanti contro ~5% delle regioni non codificanti. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

18 Gene Finding: Segnali di codifica
Molti esanucleotidi mostrano grosse differenze di frequenza tra zone codificanti e non codificanti. Fondamenti per rilevare regioni codificanti La frequenza delle coppie di codoni sono segnali chiave usati per identificare regioni codificanti; Tutti i programmi di gene prediction se ne avvalgono. Regioni di DNA dove sono presenti moltissimi esanucleotidi che sono risultati frequenti in regioni codificanti già appurate, sono probabilmente regioni codificanti; al contrario sono regioni non codificanti. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

19 Gene Finding: Modello preferenziale
Per ogni esanucleotide X (es: AAA AAA), calcolare la sua frequenza in regioni codificanti (FC(X)) e non codificanti (FN(X)) Calcolare il valore della preferenza di X: P(X) = log(FC(X)/FN(X)) Proprietà P(X) vale 0 se X ha la stessa frequenza sia nelle regioni codificanti, che in quelle non codificanti. P(X) ha un valore positivo, se X compare più spesso in regioni codificanti rispetto a quelle non codificanti; più grande è la differenza più alto sarà il valore di P(X). P(X) ha un valore negativo, se X ha frequenza maggiore in regioni non codificanti; più grande è la differenza più piccolo sarà il valore di P(X). Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

20 Gene Finding: Modello preferenziale
Esempi AAA ATT e AAA GAC hanno le seguenti frequenze FC(AAA ATT) = 1.4%, FN(AAA ATT) = 5.2% FC(AAA GAC) = 1.9%, FN(AAA GAC) = 4.8% Avremo P(AAA ATT) = log (1.4/5.2) = -0.57 P(AAA GAC) = log (1.9/4.8) = -0.40 Una regione formata solo da esanucleotidi di questo tipo, è probabilmente una regione non codificante. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

21 Gene Finding: Modello preferenziale
Perché usiamo un modello basato su coppie di codoni ? Modelli basati su singolo codone spesso non danno abbastanza informazione per capire se siamo davvero in una regione codificante o meno. Modelli basati su triple di codoni hanno bisogno di moltissimi dati per rendere attendibile la statistica. 4*4*4 = 64 codoni 4*4*4*4*4*4 = 4,096 coppie di codoni 4*4*4*4*4*4*4*4*4= 262,144 triple di codoni Nel caso di triple di codoni avremo quindi necessità di avere almeno un numero elevatissimo di sequenze caratterizzate per popolare la matrice delle frequenze Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

22 a1,b1,c1,a2,b2,c2,……,anbncn,an+1bn+1cn+1
Gene Finding: Predizione di una regione codificante Un semplice modello basato sulle frequenze dei codoni: Sia fabc la frequenza con la quale il codone abc occorre in una regione codificante. Data la coding sequence a1,b1,c1,a2,b2,c2,……,anbncn,an+1bn+1cn+1 la probabilità di osservare la sequenza di n codoni nei vari frame di lettura: p1 = fa1,b1,c1 x fa2,b2,c2 x … x fan,bn,cn p2 = fb1,c1,a2 x fb2,c2,a3 x … x fbn,cn,an+1 p3 = fc1,a2,b2 x fc2,a3,b3 x … x fcn,an+1,bn+1 Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

23 Gene Finding: Predizione di una regione codificante
Denotiamo con Pi la probabilità dell’i-esimo frame di lettura come: E’ possibile utilizzare in un algoritmo per la ricerca di regioni codificanti nel modo seguente: Consideriamo finestre di size n e calcoliamo Pi per ogni punto di start; Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

24 Gene Finding: Predizione di una regione codificante
plot di log(p/(1-p)) per i tre frame di lettura: In questo frame di lettura il gene è chiaramente riconosciuto gene Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

25 Gene Finding: Soglia minima
Regione codificante? Dove sono i confini ? Decidiamo un valore di soglia per marcare una regione come codificante. Tale valore deve essere scelto testandolo su un training set. Deve essere tale da trovare il maggior numero di regioni codificanti ed escludere il maggior numero di regioni non codificanti. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

26 Esone Introne Esone Gene Finding: Boundary Esoni/Introni
Usando come training set, sequenze di DNA la cui suddivisione esoni/introni sia conosciuta, alliniamo tali sequenze rispetto ai due siti di splicing. Esone Introne Esone  --gaggcatcag|gtttgtagac tgtgtttcag|tgcacccact-- --ccgccgctga|gtgagccgtg tctattctag|gacgcgcggg-- --tgtgaattag|gtaagaggtt atatctacag|atggagatca-- --ccatgaggag|gtgagtgcca ttatttgcag|gtatgagacg-- Splice site Splice site Esone Introne Esone  --gaggcatcag|GTttgtagac tgtgtttcAG|tgcacccact-- --ccgccgctga|GTgagccgtg tctattctAG|gacgcgcggg-- --tgtgaattag|GTaagaggtt atatctacAG|atggagatca-- --ccatgaggag|GTgagtgcca ttatttgcAG|gtatgagacg-- Splice site Splice site Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

27 Gene Finding: Segnali associati con gli estremi di una regione codificante
Entrambi i siti di splicing hanno particolari profili di distribuzione nell’uso dei nucleotidi Distribuzione dei nucleotidi attorno al Sito Accettore (Genoma Umano). Y75 Y72 Y78 Y79 Y77 Y80 Y66 Y85 Y84 N C68 A G G63 -14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 1 11,1 12,7 3,2 4,8 8,7 16,7 9,5 26,2 6,3 100 0,0 21,4 C 36,5 30,9 19,1 23,0 34,9 39,7 40,5 33,3 68,2 7,9 10,3 15,1 2,4 13,5 62,7 T 38,9 41,3 58,7 55,6 42,1 37,3 44,4 47,6 27,0 25,4 0,00 Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

28 Gene Finding: Segnali associati con gli estremi di una regione codificante
Entrambi i siti di splicing hanno particolari profili di distribuzione nell’uso dei nucleotidi Distribuzione dei nucleotidi attorno al Sito Donatore (Genoma Umano). -3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 A 34,0 60,4 9,2 0,0 52,6 71,3 7,1 16,0 C 36,3 12,9 3,3 2,8 7,6 5,5 16,5 G 18,3 12,5 80,3 100 41,9 11,8 81,4 20,9 T 11,4 14,2 7,3 2,5 9,3 5,9 46,2 Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

29 Gene Finding: Procedura per identificare i segnali
Creare le matrici pesate per i siti donatori e accettori. Sommiamo le frequenze delle lettere corrispondenti nelle posizioni corrispondenti -3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 A 34,0 60,4 9,2 0,0 52,6 71,3 7,1 16,0 C 36,3 12,9 3,3 2,8 7,6 5,5 16,5 G 18,3 12,5 80,3 100 41,9 11,8 81,4 20,9 T 11,4 14,2 7,3 2,5 9,3 5,9 46,2 …AAGGTAAGTGTCTCA… AAGGTAAGT:( )/100= 6.262 Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

30 Gene Finding: Procedura per identificare i segnali
Creare le matrici pesate per i siti donatori e accettori. Sommiamo le frequenze delle lettere corrispondenti nelle posizioni corrispondenti -3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 A 34,0 60,4 9,2 0,0 52,6 71,3 7,1 16,0 C 36,3 12,9 3,3 2,8 7,6 5,5 16,5 G 18,3 12,5 80,3 100 41,9 11,8 81,4 20,9 T 11,4 14,2 7,3 2,5 9,3 5,9 46,2 …AAGGTAAGTGTCTCA… AGTGTCTCA:( )/100= 2.874 Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

31 Gene Finding: Identificare i segnali
In corrispondenza di un sito di splicing, la corrispondente funzione di score avrà un picco significativo. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

32 Gene Finding: Rappresentazione grafica della regione codificante di un gene eucariotico
Vengono scelti tra gli esoni predetti un insieme che non causa overlapping Frame 1 Frame 2 Frame 3 Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

33 Gene Finding: Ulteriori segnali
Segnali che identificano la trascrizione TATA-Box (25-30 basi prima dello start) presente nel 70% dei casi sito di PolyA (AATAAA oppure ATTAAA) Segnali che identificano i promotori Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

34 Gene Finding: Ulteriori dati statistici
Distribuzione lunghezza esoni 150 bp Distribuzione lunghezza introni 60 bp Una regione ricca di G+C è indice della presenza di un gene (vale solo per i genomi degli eucarioti superiori) 50% G+C Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

35 Gene Finding: Modelli di Markov
La probabilità di un evento dipende dagli eventi precedenti Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

36 Gene Finding: Probabilità di una sequenza di eventi
P(Sole, Pioggia, Pioggia, Pioggia, Neve, Neve) = P(Sole) P(Pioggia | Sole) P(Pioggia | Pioggia) P(Pioggia | Pioggia) P(Neve | Pioggia) P(Neve | Neve) Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

37 Gene Finding: Modelli di Markov Nascosti (HMM)
Quale è la sequenza meteorologica più probabile che ha generato questa sequenza di azioni? Assunzione (First order Markov chains): La probabilità di un evento dipende solo dal precedente. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

38 Probabilità di transizione dalla regione I alla II con la sequenza TT
Gene Finding: Modelli di Markov Nascosti (HMM) ESEMPIO Creiamo un modello per distinguere due regioni (per semplicità supponiamo siano presenti solo due nucleotidi) I II ATTA TTAT AAAT TAAT … TTAA TATA ATAT ATTT Probabilità di transizione dalla regione I alla II con la sequenza TT Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

39 Gene Finding: Modelli di Markov Nascosti (HMM) ESEMPIO
A quale regione appartiene la sequenza TTAT ? Calcoliamo la probabilità di tutte le possibili sequenze di nucleotidi appartenenti alle due regioni. TITIAITI=1.1x10-1 TITIIAITI=1.8x10-3 TIITIAITI=6.0x10-3 TIITIIAITI=9.0x10-3 TITIAITII=8.8x10-3 TITIIAITII=1.4x10-4 TIITIAITII=4.8x10-4 TIITIIAITII=7.2x10-4 TITIAIITI=5.5x10-4 TITIIAIITI=1.0x10-3 TIITIAIITI=3.0x10-5 TIITIIAIITI=5.2x10-3 TITIAIITII=1.4x10-4 TITIIAIITII=8.4x10-3 TIITIAIITII=2.4x10-4 TIITIIAIITII=4.2x10-2 Risulta più probabile che la sequenza appartiene integralmente alla regione I Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

40 Gene Finding: Genscan http://genes.mit.edu/GENSCAN.html
Il tool di gene prediction più utilizzato Presenta il miglior compromesso tra Sensibilità e Specificità (sono due misure di accuratezza) Largamente utilizzato dal Consorzio Internazionale durante il Progetto Genoma Umano Utilizza come algoritmo di base l’ Hidden Markov Model (generalizzato) Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

41 E0 E1 E2 I0 I1 I2 Einit Eterm Esngl P N
Gene Finding: Genscan è basato su HMM Le coppie di introni/esoni rappresentano i differenti modi in cui un introne può interrompere una coding sequence (dopo la 1° base, dopo la 2° o dopo la 3°) E0 E1 E2 I0 I1 I2 Esone iniziale e finale Einit Eterm 3’ UTR 5’ UTR Esngl polyA P Filamento sense N ………………… ………………….. Filamento antisense Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

42 Gene Finding: Misura dell’accuratezza nella predizione
Scelta una caratteristica (es: identificazione esoni) Possiamo definire i seguenti valori TP (true positive) = Numero di esoni predetti, che sono risultati veri esoni. FP (false positive) = Numero di esoni predetti che sono in realtà dei falsi. TN (true negative) = Numero di esoni falsi, identificati come tali. FN (false negative)= Numero di esoni reali, identificati come falsi. Avremo le seguenti misure Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

43 (Parametri calcolati a livello nucleotidico)
Gene Finding: Confronto tra tool di gene predictioon (Parametri calcolati a livello nucleotidico) Coefficiente di correlazione Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

44 Gene Finding: Interfaccia Genscan
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45 Gene Finding: Output di Genscan
Inizio, Fine e lunghezza dell’ elemento calcolato Probabilità che l’elemento sia un esone Score del sito Accettore e Donatore di splicing Numerazione del Gene e dei suoi elementi Filamento sul quale viene fatta la predizione Frame del primo codone dell’elemento Score della coding sequence calcolata Score complessivo dell’esone Tipo di elemento riconosciuto Proteina predetta sulla base della CDS calcolata Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

46 Gene Finding: Esempio di uso di GenScan
Eseguire con Genscan la scansione del frammento di genoma di Homo sapiens >gi| |gb|AF |AF007546 Utilizzare la proteina predetta da Genscan per fare un BLAST proteico (BLASTP) per vedere a cosa corrisponde la predizione fatta da Genscan. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007