La biologia molecolare nella diagnostica virologica

Presentazione sul tema: "La biologia molecolare nella diagnostica virologica"— Transcript della presentazione:

1 La biologia molecolare nella diagnostica virologica
Corso di perfezionamento Nuovi sviluppi nella diagnostica microbiologica e virologica

2 Diagnostica virologica
metodi diretti definizione Dimostrazione del virus o suoi componenti Ricerca dei virioni al M.E. Ricerca dell’infettività virale Ricerca degli Ag virali Ricerca del genoma virale Tipo di metodo

3 Ricerca delle sequenze nucleotidiche
Quali virus ? difficilmente o non coltivabili (HBV, HCV, papillomavirus, parvovirus B19) a lento sviluppo (CMV, BKV, JCV) pericolosi da coltivare (HIV) emergenti (TTV)

4 Ricerca delle sequenze nucleotidiche
Quando ? campioni con la carica virale molto bassa (liquor – HIV, HSV, JCV) distinzione tra infezione latente e attiva (CMV, HSV) riduzione “periodo finestra” (HIV, HCV) monitoraggio delle infezioni croniche  valutazione prognostica monitoraggi terapeutici genotipizzazione

5 Ricerca delle sequenze nucleotidiche amplificazione  ibridazione
sequenze bersaglio amplificazione  ibridazione sequenze bersaglio

6 Ibridazione degli acidi nucleici
reazioni bimolecolari fra una molecola bersaglio (target) e una molecola sonda (probe), in cui catene complementari di acidi nucleici si associano a formare molecole a doppia catena

7 Sonde (probes) sequenze di DNA o di RNA complementari alla sequenza bersaglio che si vuole cercare acidi nucleici purificati e clonati in vettori genetici oligonucleotidi di sintesi sonde generiche o specifiche dotate di un sistema di rivelazione Sonde “calde” 32P, 35S  visualizzazione dell’ibrido tramite autoradiografia Sonde “fredde” Fluorochromi Biotina Digossigenina fluorescenza sistemi immunoenziamtici o enzimatici rivelazione colorimetrica o chemiluminescente

8 sistema di rivelazione
detection in gene probe assays: (a) enzyme-labeled gene probe (b) hapten-labeled gene probe detected with labeled anti-hapten antibody (c) unlabeled gene probe and hybrid detection by means of anti-hybrid antibody and labeled anti-species antibody

9 Sistema immunoenzimatico
Sistema enzimatico Sistema immunoenzimatico

10 Ibridazione in soluzione con successiva cattura dell’ibrido su matrice solida membrana (dot-blot, gel-blot), micropiastra in situ all’interno di cellule, con mantenimento della morfologia cellulare e tessutale

11 Hybrid Capture II ibridazione in fase liquida, cattura su pozzetto
rivelazione chemiluminescente Denaturazione Ibridazione Cattura Rivelazione Acquisizione HPV PROBE A: pool di sonde a RNA per HPV-LR: 6, 11, 42, 43 e 44 HPV PROBE B: pool di sonde a RNA per HPV-HR: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68 Sensiblità copie

12 Ibridazione sul filtro (dot-blot)
32P autoradiografia dig  coniugatoDigAP  X-fosfato + NTB

13 Rivelazione multicolore

14 Metodi di amplificazione
metodo substrato thermal cycling PCR target DNA si RT-PCR target RNA si NASBA target RNA no LCR sonda si Q sonda no bPCR segnale no

15 amplificazione del DNA target Polymerase Chain Reaction (PCR)
amplificazione di una sequenza di DNA compresa tra due brevi sequenze definite Master mix - 4 dNTP - DNA polimerasi termostabile - 2 oligonucleotidi (primers) denaturazione appaiamento volte estensione

16 Polymerase Chain Reaction (PCR)

17 Rivelazione dei prodotti amplificati
presenza della banda dimensioni della banda Conferma della specificità - sequenziamento - Southern blotting - analisi con enzimi di restrizione

18 Rivelazione e identificazione di virus polio mediante RT-PCR e tipizzazione mediante RFLP.
HaeIII HaeIII DdeI HaeIII DdeI DdeI M 480 pb 1: Sabin 1 2: Sabin 2 3: Sabin 3 M: bp ladder 1: Sabin 1 2: Sabin 2 3: Sabin 3 4: “0” RNA 5: virus polio 1 di isolamento clinico 6: virus polio 2 di isolamento clinico 7: virus polio 3 di isolamento clinico 8: pb ladder

19 Rivelazione dei prodotti amplificati
PCR/ELISA ampliWell Parvo ID (Microgen) sensibilità: 10 UI standard internazionale (WHO): 1 UI  1 genoma Possibilità di quantificare il prodotto

20 Rivelazione dei prodotti amplificati
DEIA (Sorin Biomedica)

21 Rivelazione dei prodotti AMPLICOR® Microwell Plate Test Format

22 Rivelazione dei prodotti
sonde marcate con estere di acridinio (AE) reattivo di selezione idrolizza AE delle sonde libere La luce emessa da AE protetto rilevata con luminometro Hybridization Protection Assay (Gene-Probe)

23 Polymerase Chain Reaction (PCR)
Reazioni più comunemente usate nel laboratorio diagnostico PCR singola PCR nested PCR multiplex RT-PCR Q-PCR (real time PCR)

24 PCR nested amplificazione mediante 2 PCR consecutive:
maggiore specificità maggiore sensibilità

25 Identificazione di bersagli differenti in una sola reazione
PCR multiplex Identificazione di bersagli differenti in una sola reazione virus differenti sequenze differenti dello stesso virus Duplex PCR per polyomavirus umani BK e JC

26 RT-PCR Trascrittasi inverse Moloney murine lekemia virus (M-MLV)
Avian myeloblastosis virus (AMV) Tth DNA polimerasi - attività di trascrittasi inversa - attività di DNA polimerasi amplificazione RNA virale genomico mRNA virali (non distingue tra DNA e RNA)

27 RT/PCR per VP1/ mRNA del parvovirus B19
Unità di mappa B19/ B19/9B primers B19/ ’ GTT TTT TGT GAG CTA ACT AAC A 3’ B19/9B 5’ CCA CGA TGC AGC TAC AAC TT 3’ prodotti ottenuti: 131pb, 251pb, 1615pb

28 RT/PCR per VP1/mRNA del parvovirus B19
(1) MWM VI Roche; (2) cellule non infettate (controllo negativo); (3) tempo 0; (4) 24 ore ; (5) 48 ore; (6) 6 giorni; (7,10) campioni bianchi; (8,9) diluizioni scalari della sequenza bersaglio clonata.

29 Nucleic Acid Sequence – Based Amplification (NASBA)
amplificazione del target RNA Nucleic Acid Sequence – Based Amplification (NASBA) prima reazione di amplificazione alternativa alla PCR (1989) TAS = Transcription - based Amplification System 3SR o SSSR = Self Sustained Sequence Replication amplificazione selettiva dell’RNA attraverso cicli ripetuti di retrotrascrizione e di trascrizione Primer antisenso 5’ sequenza promotore per la T7 RNA polimerasi utilizza 3 enzimi - trascrittasi inversa AMV - T7 RNA polimerasi - Rnasi H Vantaggi (NASBA vs. RT/PCR) reazione isotermica sintesi selettiva del RNA: identificazione virus a RNA, identificazione della riattivazione dei virus latenti può essere utilizzata in versione quantitativa elevata sensibilià e specificità

30 Nucleic Acid Sequence – Based Amplification NASBA

31 amplificazione della sonda Ligase Chain Reaction (LCR)
Amplificazione di prodotti di ligazione complementari alla sequenza bersaglio Master mix - DNA ligasi termostabile - 4 oligonucleotidi - DNA polimerasi (Gap-LCR) Denaturazione Appaiamento, ligazione 25 volte

32 Ligase Chain Reaction (LCR)
p1 p2 p3 p4

33 Ligase Chain Reaction (LCR)
Gap – LCR

34 amplificazione della sonda Amplificazione con la Q Replicasi
sequenza complementare alla sequenza bersaglio + Q RNA (MDV-1 RNA) Enzimi replicasi Q = RNA polimerasi RNA dipendente in grado di duplicare la molecola Q RNAsi III

35 amplificazione della sonda Amplificazione con la Q Replicasi

36 ibridazione sandwich con una serie di sonde
- sonde di cattura (capture probes) - sonde “leganti” (extender probes) - sonde di amplificazione ramificate (bDNA probes) - sonde marcate con enzima (reporter probes)

37 amplificazione del segnale Branched chain DNA (bDNA)
Non richiede la purificazione del campione Non soggetta alle contaminazioni Segnale generato dal prodotto della reazione enzimatica è direttamente proporzionale alla carica virale  applicazioni quantitative

38 Tecniche molecolari vantaggi limiti Elevata sensibilità e specificità
Ricerca di virus difficilmente o non coltivabili Identificazione e tipizzazione Quantificazione del prodotto Facile automazione Rapidità di esecuzione vantaggi Rischio di contaminazioni  falsi positivi Rischio di cross-reazioni con acidi nucleici non specifici Rischio di falsi negativi per inibitori Alti costi limiti