Lezione 2-3 13/X/06 Cosa dobbiamo sapere La doppia elica: orientamento dei due filamenti 5-3 DNA pol i cromatidi da cosa sono costituiti ? quale è il verso.

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1 Lezione 2-3 13/X/06 Cosa dobbiamo sapere La doppia elica: orientamento dei due filamenti 5-3 DNA pol i cromatidi da cosa sono costituiti ? quale è il verso di trascrizione della RNA pol II coding strand* = filamento trascritto = mRNA * non è il templato cDNA (DNA complementare al messaggero) da distinguere dalla Coding Sequence a volte confusa col cDNA La sequenza codificante corrisponde all RNA messaggero contiene i codoni che vengono tradotti

2 Trascrizione e complemetarietà In banca dati la sequenza di un gene è indicata nel verso di trascrizione e corrisponde alla coding sequence che è uguale al messaggero (salvo T U) Le sequenze per convenzione si scricvono sempre 53 salvo quando si mostra una doppia elica in cui cè la complementare che è antiparallela

3 Trascrizione orientamento e verso La sequenza coding non è il templato SBAGLIATOSBAGLIATO

4 Quale strand è trascritto? che verso ha ?

5 Rna polimerasi II

6 DNA templato della trascrizione Tutte le pol sintetizzani 5-3 su un templato 3- 5 antiparallelo schema giusto

7 Cosa è un Southern blot DNA digerito con enzimi di restrizione - trasferito su filtro - Ibridato con una sonda marcata di DNA a doppio filamento denaturato o con singolo filamento Studio di mappe di restrizione genomiche per individuare i frammenti di restrizione che contengono una data porzione di DNA o un frammento di un gene, Studio di un gene a partire da un cDNA

8 Gel BrEt x Southern

9 Foto Southern A: Genomic P1 clone (0.3 ug) and B: human genomic DNA (10 ug) were digested with EcoRI (E), BamHI (B), HindIII (H) and PstI (P). The digested samples were separated on a 1% agarose TBE gel, blotted and hybridized with a PEDF cDNA probe. A 1 kb ladder is given to show relative sizes of the hybridizing bands. The figure shows similarities in restriction pattern between the genomic DNA and the P1 clone.

10 Cosa si analizza con un Northern blot La trascrizione cellulare

11 Foto Northern (lattato deidrogenasi)

12 Le sonde (probes) Sonde a DNA doppio o singolo filamento anche ad RNA** Sonde clonate o amplificate Plasmidi con promotore di trascrizione Sp6** Sonde marcate ( 32 P) o fluorescenti Southern o Northern tipi di sonde uguali Per Northern uso di sequenze trascritte

13 Dallespressione al genoma e viceversa Con le sonde dei cDNA al genoma (mappa e regioni non trascritte) Con le sonde genomiche ricerca di geni Uso dei marcatori Ricerche di tutte le sequenze trascritte come marcatori Da sequenze ripetute mappature cromosomiche

14 Struttura e regolazione dei geni Perché i geni sono regolati Meccanismi di regolazione dei geni Differenze tra procarioti ed eucarioti Differenti strutture regolative analizzate con geni reporter e utilizzate allinterno di plasmidi e vettori per espressione Dovete sapere come è strutturato un gene, differenze tra procarioti ed eucarioti, geni costitutivi e house keeping, geni inducibili, regolati e tessuto specifici. (corso di bio molec.)

15 Che vuol dire clonare a che serve come si fa I cloni in microbiologia o genetica dei microoranismi I colonia (clone) deriva dalle mitosi di una singola cellula e contiene qualche centinaio di migliaia di cellule

16 Cloni di cellule eucariotiche

17 Esperimenti olistici ( progr. euristici autoincr.) Phenotypic alteration of eukaryotic cells using randomized libraries of artificial transcription factors Nature Biotechnology 21, 1208 - 1214 (2003) Published online: 7 September 2003; | doi:10.1038/nbt868 Kyung-Soon Park1, 2, Dong-ki Lee1, 2, Horim Lee1, Yangsoon Lee1, Young-Soon Jang1, Yong Ha Kim1, Hyo-Young Yang1, Sung-Il Lee1, Wongi Seol1 & Jin-Soo Kim1 Correspondence should be addressed to Jin-Soo Kim jsk@toolgen.comjsk@toolgen.com We have developed a method in which randomized libraries of zinc fingercontaining artificial transcription factors are used to induce phenotypic variations in yeast and mammalian cells. By linking multiple zinc-finger domains together, we constructed more than 100,000 zinc-finger proteins with diverse DNA- binding specificities and fused each of them to either a transcription activation or repression domain. The resulting transcriptional regulatory proteins were expressed individually in cells, and the transfected cells were screened for various phenotypic changes, such as drug resistance, thermotolerance or osmotolerance in yeast, and differentiation in mammalian cells. Genes associated with the selected phenotypes were also identified. Our results show that randomized libraries of artificial transcription factors are useful tools for functional genomics and phenotypic engineering.

18 Clonaggio come manipolazione di DNA Clonaggio :plasmidi enzimi di restrizione Clonaggio perché i cloni sono isogenici e se contengono un plasmide si moltiplica con le cellule Le cellule trasfettate col plasmide si clonano

19 Strategia e metodo di clonaggio Extraction of Viral RNA and Conversion to DNA RNA Reverse Transcription DNA

20 Cloning a Gene into a Plasmid PCR DNA encoding gene of interest Cloning pl plasmid Amplificazione tramite PCR Gene codificante di interesse clonaggio Plasmide di espressione

21 Growth and Purification of Plasmids trasfezione crescita batterica col plasmide tramite selezione estrazione del DNA Purificazione del plasmide

22 Recombinant DNA Technology and Vaccine Development Vaccine vector Cellule eucariotiche produzione dellantigene In vitro vettore col vaccino Produzione dellantigene in vivo