Metodi di sequenziamento

Presentazione sul tema: "Metodi di sequenziamento"— Transcript della presentazione:

1 Metodi di sequenziamento
Sanger (enzimatico) Maxam e Gilbert (chimico)

2 Metodo di Sanger primer quattro dNTP (incluso 32PdNTP) DNA polimerasi
ddTTP ddCTP ddGTP ddATP primer nuovo DNA dideossinucleotide terminatore La catena neosintetizzata termina quando un ddNTP è incorporato al posto di un dNTP Denaturare e separare su gel di poliacrilammide

3 Metodo di Maxam e Gilbert
DNA singolo filamento marcato ad una estremità 4 o 5 reazioni di modificazione base-specifiche Es. metilazione delle G con dimetilsolfato Rottura del filamento in corrispondenza della base modificata mediante piperidina Separare i frammenti marcati su gel di acrilammide

4 Gel di poliacrilammide di sequenza

5 Confronto metodi di sequenziamento
Sanger rapida e semplice attuazione disponibilità di kit necessità di primer sensibile a strutture secondarie Maxam e Gilbert lunga preparazione del DNA reazioni da mettere a punto relativamente economico strutture non influenti utilizzabile per oligonucleotidi

6 Sequenziamento automatico

7 Sequenziamento con Taq polimerasi

8 Trasferimento di acidi nucleici
(Blotting) Southern Northern

9 Schema trasferimento

10 Schema ibridazione

11 Metodi di trasferimento
Capillare Elettroblot

12 Assemblaggio del blot capillare
vaschetta tampone carta 3MM carta 3MM } membrana nylon gel supporto

13 Assemblaggio dell’elettroblot
membrana nylon carta 3MM gel spugnette - + tampone

14 Analisi di espressione con Northern blot

15 Altre tecniche di analisi
Estensione del primer (primer extension) Protezione dalla S1/RNasi (mapping) RT-PCR

16 Estensione del primer mRNA totale cap mRNA globina 3’ 5’
oligo antisenso marcato ibridazione estensione con RT Analisi dei frammenti estesi su gel di sequenza frammento protetto

17 Protezione da RNasi (RNase Protection)
mRNA totale sonda RNA antisenso mRNA globina cap 5’ 3’ ibridazione trattamento con RNasi Analisi dei frammenti protetti su gel di sequenza frammento protetto inizio trascrizione

18 Analisi interazioni DNA-proteine: saggio di footprinting

19 Analisi interazioni DNA-proteine:
saggio EMSA

20 Sistemi di espressione
In vitro (estratti cellulari) In vivo (cellule in coltura) Animali transgenici

21 Gene reporter

22 Trasformazione del lievito (Saccharomyces cerevisiae)
diversi tipi di vettori vettori “navetta” batteri-lievito possibilità di ricombinazione omologa

23 Vettori di clonaggio per lievito

24 Ricombinazione omologa

25 Trasfezione di cellule in coltura
transiente stabile vettori episomali

26 Vettore di espressione in cellule di mammifero

27 Trasfezione in cellule in coltura

28 Vettori episomali

29 Metodi di trasfezione fosfato di calcio liposomi (e simili)
elettroporazione virus (SV40, retrovirus)

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31 Descrizione generale esercitazioni di laboratorio
Studio della localizzazione intracellulare della proteina SEC4 del lievito Saccaromyces cerevisiae Clonaggio di SEC4 in vettore per l'espressione in lievito di proteine di fusione con "tag" (GFP) Espressione di SEC4 in lievito e analisi della sua localizzazione mediante western blot di estratti frazionati Parte A 1) Isolamento di DNA genomico da lievito (I parte) 2) Isolamento di DNA genomico da lievito (II parte) Analisi spettrofotometrica del DNA preparato PCR su DNA genomico (preparazione frammento da clonare) 3) Preparazione di DNA plasmidico (vettore di clonaggio) con colonnina Digestione DNA (vettore e frammento) con enzimi di restrizione 4) Analisi su gel di agarosio Reazione con enzima "ligasi" 5) Preparazione piastre di agar Trasformazione batterica 6) Analisi risultati trasformazione Minipreparazione DNA plasmidico 7) Analisi su gel di agarosio 8) Fasi iniziali di Southern blot

32 Clonaggio con doppia digestione
EcoRI HindIII  GAATTC CTTAAG  AAGCTT TTCGAA  AGCTT A G CTTAA  GAATTC CTTAAG AAGCTT TTCGAA DNA ligasi AATTC G A TTCGA EcoRI HindIII  GAATTC CTTAAG  AAGCTT TTCGAA

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34 Trasfezione con liposomi

35 Elettroporazione

36 Vettori virali

37 Vettori retrovirali