Tre criteri fondamentali per la produzione di proteine eterologhe

Presentazione sul tema: "Tre criteri fondamentali per la produzione di proteine eterologhe"— Transcript della presentazione:

1 Tre criteri fondamentali per la produzione di proteine eterologhe
Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA) La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in E. coli (livello struttura/ conformazione della proteina) La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare

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3 Step 2: dalla trascrizione alla proteina
3’ 5’

4 Gli enzimi sono attivi solo se ripiegati
nella conformazione corretta (folding)

5 Nel processo di folding hanno luogo modificazioni post-traduzionali: es. Folding ossidativo

6 Soltanto il corretto appaiamento di residui di cisteina porta alla conformazione biologicamente attiva

7 Nel processo di folding hanno luogo
modificazioni post-traduzionali: es. Glicosilazione

8 E. coli: nel citoplasma la formazione di ponti disolfuro è estremamente sfavorita
Il citoplasma ha un potenziale redox molto basso (ambiente riducente) Nel citoplasma non ci sono enzimi che sono in grado di ossidare i tioli (-SH)

9 Foldasi e chaperonine Foldasi: 1) prolil cis-trans isomerasi (es. ppiA) 2) disolfuro isomerasi (eucariotiche) +

10 Foldasi e chaperonine Foldasi: 1) prolil cis-trans isomerasi (es. ppiA) 2) disolfuro isomerasi (eucariotiche) Chaperonine

11 Foldasi e chaperonine Foldasi: 1) prolil cis-trans isomerasi (es. ppiA) 2) disolfuro isomerasi (eucariotiche) Chaperonine

12 Foldasi e chaperonine Foldasi: 1) prolil cis-trans isomerasi (es. ppiA) 2) disolfuro isomerasi (eucariotiche) Chaperonine

13 Gene name Gene length SWISS-PROT Location (kb) Description dnaJ 1131 P08622 14.20 Chaperone with DnaK; DNA chain elongation; stress-related DNA biosynthesis, responsive to heat shock dnaK 1917 P04475 12.20 HSP-70-type molecular chaperone, with DnaJ; stress-related heat-shock DNA biosynthesis, ATP-regulated binding and release of polypeptide substrates ecpD 741 P33128 156.20 Possible pilin chaperone fimC 726 P31697 Biosynthesis of fimbriae; periplasmic chaperone for type 1 fimbriae groL 1647 P06139 Chaperone for assembly of enzyme complexes; phage morphogenesis; GroESL large subunit groS 294 P05380 Chaperone for assembly of enzyme complexes; phage morphogenesis; GroESL small subunit htpG 1875 P10413 494.30 Heat shock protein C62.5; chaperone ibpA 414 P29209 Chaperone, heat-inducible protein of HSP20 family ibpB 429 P29210 narJ 711 P11351 Nitrate reductase delta-subunit; chaperone secB 468 P15040 Protein export; chaperone SecB tig 1299 P22257 454.40 Trigger factor; chaperone

14 „Mettersi in riga“ o venire eliminati: il ruolo delle chaperonine

15 Struttura del complesso GroEL/GroES
(una della maggiori chaperonine citoplasmatiche) A) Veduta laterale B) Veduta apicale e basale

16 DnaK

17 Alto livello di espressione + errata conformazione
Inclusion bodies

18 Vettori per l‘espressione di chaperonine

19 Il successo si consuma a freddo: i vettori per espressione a basse temperature

20 Inclusion bodies: se li conosci li eviti
La formazione di corpi di inclusione può essere ridotta: 1) crescendo a bassa temperatura (ad es. 16°C) 2) riducendo la velocità di espressione del gene 3) cercando di rendere meno riducente il citoplasma 4) aumentando l’espressione di chaperonine o di enzimi che promuovono la formazione di ponti disolfuro

21 Inclusion bodies: se li conosci li eviti ma non necessariamente
La formazione di corpi di inclusione può essere ridotta: 1) crescendo a bassa temperatura (ad es. 16°C) 2) riducendo la velocità di espressione del gene 3) cercando di rendere un pò meno riducente il citoplasma 4) aumentando l’espressione di chaperonine o di enzimi che promuovono la formazione di ponti disolfuro Possono essere il punto di partenza, una volta purificati per la preparazione di un proteina d’interesse

22 L’involucro dei batteri Gram negativi

23 Lo spazio periplasmico è un ambiente ossidante
Gram+ L’aggiunta di peptidi segnale favoriscono il trasporto dal citoplasma allo spazio periplasmatico (es. MKTHRLNMTASLLIGISAFA ) La proteina periplasmatica DsbA induce la formazione di ponti disolfuro tra cisteine

24 Espressione di proteine ricombinanti in Echerichia coli
Vantaggi - Crescita rapida - Elevata densità cellulare su substrati poco costosi Organismo molto ben caratterizzato e ricca collezione di mutanti Numero elevato di vettori di clonaggio ed espressione Svantaggi Formazione di inclusion bodies Folding ossidativo limitato allo spazio periplasmico Modificazioni post-traduzionali non adeguate (ad es. glicosilazione)

25 Schema generale di preparazione di una proteina ricombinante in E. coli
1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) in un opportuno vettore d’espressione 2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione dell’espressione al fine di ottenere la massima produzione di proteina solubile, o insolubile, se si sceglie la strada dei corpi d’inclusione 3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di E. coli che esprime la proteina 4) Lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 5) Purificazione della proteina d’ interesse mediante tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi citoplasmatici o periplasmici 6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei corpi d’inclusione. Rinaturazione in vitro della proteina d’interesse

26 Schema generale di preparazione di una proteina ricombinante in E. coli
1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) in un opportuno vettore d’espressione 2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione dell’espressione al fine di ottenere la massima produzione di proteina solubile, o insolubile, se si sceglie la strada dei corpi d’inclusione 3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di E. coli che esprime la proteina 4) Lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 5) Purificazione della proteina d’ interesse mediante tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi citoplasmatici o periplasmici 6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei corpi d’inclusione. Rinaturazione in vitro della proteina d’interesse

27 Schema generale di preparazione di una proteina ricombinante in E. coli
1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) in un opportuno vettore d’espressione 2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione dell’espressione al fine di ottenere la massima produzione di proteina solubile, o insolubile, se si sceglie la strada dei corpi d’inclusione 3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di E. coli che esprime la proteina 4) Raccolta e lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 5) Purificazione della proteina d’ interesse mediante tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi citoplasmatici o periplasmici 6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei corpi d’inclusione. Rinaturazione in vitro della proteina d’interesse

28 Schema generale di preparazione di una proteina ricombinante in E. coli
1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) in un opportuno vettore d’espressione 2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione dell’espressione al fine di ottenere la massima produzione di proteina solubile, o insolubile, se si sceglie la strada dei corpi d’inclusione 3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di E. coli che esprime la proteina 4) Raccolta e lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 5) Purificazione della proteina d’ interesse mediante tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi citoplasmatici o periplasmici 6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei corpi d’inclusione. Rinaturazione in vitro della proteina d’interesse

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30 % delle proteine totali
Rese di produzione Per cellula Per litro a 109 cells/ml Peso umido 9.5x10-13 g 0.95 g Peso secco 2.8x10-13 g 0.28 g Proteine totali 1.55x10-13 g 0.15 g Rese massime teoriche di una proteina d’interesse per litro di coltura a 109 cells/ml % delle proteine totali Resa/litro 0.1 150 mg 2.0 3 mg 50.0 75 mg

31 Schema generale di preparazione di una proteina ricombinante in E. coli
1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) in un opportuno vettore d’espressione 2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione dell’espressione al fine di ottenere la massima produzione di proteina solubile, o insolubile, se si sceglie la strada dei corpi d’inclusione 3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di E. coli che esprime la proteina 4) Raccolta delle cellule e lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 5) Purificazione della proteina d’ interesse mediante tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi citoplasmatici o periplasmici 6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei corpi d’inclusione. Rinaturazione in vitro della proteina d’interesse

32 Raccolta: filtrazione e centrifugazione
Per lisare le cellule: lisozima sonicazione French Press Nel caso di espressione periplasmatica si lisa solo lo spazio periplasmico con shock osmotico French Press

33 Schema generale di preparazione di una proteina ricombinante in E. coli
1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) in un opportuno vettore d’espressione 2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione dell’espressione al fine di ottenere la massima produzione di proteina solubile, o insolubile, se si sceglie la strada dei corpi d’inclusione 3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di E. coli che esprime la proteina 4) Lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 5) Purificazione della proteina d’ interesse mediante tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi citoplasmatici o periplasmici 6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei corpi d’inclusione. Rinaturazione in vitro della proteina d’interesse

34 Fusioni traduzionali possono aiutare il processo di purificazione della proteina d’interesse attraverso cromatografia d’affinità Peptidi o proteine che possiedono affinità per un particolare substrato possono essere “fusi”alla proteina di interesse per facilitarne la purificazione Possono essere fusioni con intere proteine (ad es. Maltose Binding Protein, Inteina, GST) Oppure con piccoli epitopi (ad es. 6xHis, peptide FLAG)