come separare questi oggetti

Presentazione sul tema: "come separare questi oggetti"— Transcript della presentazione:

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2 1 1 3 2 4 2 3 4 4 4 come separare questi oggetti 6 5 6 5 6 5 5 7 8 9 8
Forma Grandezza Densità 1 3 4 6 7 8 9 10 11 12 2 5 lana pietra cotone lana lana cotone pietra lana pietra cotone pietra cotone 1 2 3 forma 4 grandezza 6 cotone lana pietra 4 8 5 8 4 6 7 8 5 Densità 5 7 9 10 11 12 Differente velocità di rotolamento Diversa grandezza Differente sedimentazione Juang RH (2004) BCbasics

3 Basic Principles of Protein Purification
Cell Organelle Homogenization Macromolecule Small molecule Cell Debris Amino acid, Sugar, Nucleotides, etc Nucleic acid Protein Carbohydrate (Lipid) Ammonium sulfate fractionation Size Charge Polarity Affinity Ion exchange, Chromatofocusing, Disc-PAGE, Isoelectric focusing Reverse phase chromatography, HIC, Salting-out Gel filtration, SDS-PAGE, Ultrafiltration Affinity chromatography, Hydroxyapatite Juang RH (2004) BCbasics

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5 Schema a Blocchi di un Sistema Cromatografico
pompa colonna RIVELATORE Soluzione di eluizione Collettore di frazioni

6 Scambio ionico: separazione
in funzione della carica

7 Importanza del pI -A pH > pI (almeno una unità) la proteina è carica negativamente e si lega a una resina a scambio anionico (SCAMBIO ANIONICO). -A pH < pI (almeno una unità) la proteina è carica positivamente e si lega a una resina a scambio cationico (SCAMBIO CATIONICO).

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11 Eluizione: -Variazione di pH -Variazione forza ionica -ioni competitivi Scambiatrice di anioni: pH decrescente -forza ionica crescente -anioni competitivi Scambiatrice di cationi: -pH crescente -forza ionica crescente -cationi competitivi

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13 Cromatografia di scambio ionico
VANTAGGI Per grandi volumi, Grandi quantità di proteina (1-5 g proteina per 100 ml), Matrice molto robusta, Condizioni molto flessibili, possibili molte variazioni. SVANTAGGI Proteine allo stesso pH e concentrazioni di sali della colonna. Ciò può essere scomodo poiché poi occorre passare in dialisi per togliere i sali.

14 GEL FILTRAZIONE

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19 Gel filtrazione

20 Una proteina sconosciuta eluisce a 170 mL:
40,000 Da (40KDa)

21 Cromatografia di affinità
Resina Braccio spaziatore Ligando

22 Cromatografia di affinità
Un ligando ad alta affinità per la proteina è legato alla matrice La proteina di interesse si lega al ligando e viene immobilizzata sulla colonna Le altre proteine vengono “lavate” via. La proteina di interesse viene eluita usando una soluzione di ligando.

23 Cromatografia di affinità
VANTAGGI Alta affinità, costanti di dissociazione nell’ordine del mM, nM o anche pM. Legame tutto o nulla: Possibili molte variazioni (affinity tags) SVANTAGGI L’ingombro sterico spesso abbassa la capacità Il braccio spaziatore può avere influenza sul legame L’eluizione può richiedere un eluente specifico

24 Affinity tags TAG LIGANDO GST MBP biotina Poli-His Proteina A
Gli affinity tags sono si ottengono attraverso la preparazione di proteine ricombinanti. Alla proteina di interesse è legato un tag che presenta affinità con un ligando: TAG GST MBP biotina Poli-His Proteina A LIGANDO Glutatione Maltosio Avidina Nichel, Zinco Anticorpi Le proteine contenenti affinity tags sono poi isolati per cromatografia di affinità con i ligandi legati alla colonna. Le proteine isolate possono poi venire primate degli affinity tag attraverso proteolisi specifica.

25 Cromatografia di affinità con anticorpi

26 Matrici attivate per immobilizzare uno specifico ligando

27 Protocollo generale di purificazione proteine

28 Obiettivi: Cattura Purificazione intermedia Polishing
Isolare, concentrare e stabilizzare la proteina bersaglio Purificazione intermedia Eliminare la maggior parte dei contaminanti Polishing Ottenere la massima purezza possibile

29 MEDIANTE ELETTROFORESI
CONTROLLO DELLO STATO DI PURIFICAZIONE MEDIANTE ELETTROFORESI

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31 (Cromatografia di ripartizione gas-liquido)
Gas cromatografia (Cromatografia di ripartizione gas-liquido)

32 Schema a blocchi di un gascromatografo

33 Esempio – separazione gas-cromatografica di urina di paziente con elevata aciduria