e proteine e 1OD = 50mg/ml di ds DNA 1OD = 40mg/ml di RNA 1OD = 33mg/ml di ssDNA.

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10 1OD = 50mg/ml di ds DNA 1OD = 40mg/ml di RNA 1OD = 33mg/ml di ssDNA

11 Legge di Lambert-Beer l in cm Al = -log10T = el c l c in M
● E’ una legge monocromatica ● Soluzioni diluite: 10-3 – 10-5 M

12 STRUMENTAZIONE SORGENTE: lampada di tungsteno (visibile) o lampada a
scarica di deuterio (UV) CAMPIONE: si alloggia in celle al quarzo (UV) o in vetro o policarbonato (visibile) CONCENTRAZIONE: bisogna sceglierla in modo tale che l’assorbanza non superi il valore di 2-3

13 Strumentazione Il materiale usato nelle parti ottiche dipende dalla lunghezza d’onda usata. UV: prismi, …. , cuvettes in quarzo o polimetil metacrilato sopra i 350 nm vetro borosilicato o provettine di plastica (polistirene) Colorimetria e spettrofotometria

14 Il “detector” è una fotocellula dove una superficie sensibile riceve fotoni ed una corrente viene generata che è proporzionale all’intensità del raggio di luce che raggiunge la superficie. Per strumenti UV/VIS ci sono due lampade: 1 al tungsteno -----> VIS 1 all’idrogeno o deuterio > UV La lunghezza d’onda di 350 nm è il punto di “switch” fra l’una e l’altra. Specchi per riflettere Monocromatore -----> seleziona la lunghezza d’onda con prismi (rifrazione) o mediante reticoli (diffrazione). Cromoforo: parte di una molecola che indipendentemente dà assorbimento (aminoacidi aromatici ) La sostanza è in soluzione !!! E’ sciolta cioè in un “mezzo” che di solito è l’acqua o un tampone. Sia il “mezzo” che il “contenitore” non devono assorbire e devono essere scelti a seconda della lunghezza d’onda.

15 DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE
Metodo gravimetrico (pesata) Bisogna avere molto campione a disposizione ed allo stato puro altrimenti l’errore può essere molto elevato. Ha siti che possono reagire con altri gruppi, molecole,... Cromofori di una proteina: legame peptidico Tyr max a 276 nm Trp max a 280 nm Phe max a nm (poco) ci si riferisce all’ aminoacido libero

16 Cromofori nelle proteine
Il legame peptidico (210 nm) Ponte disolfuro (250 nm) Centrato a 280 nm

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18 Metodo diretto Metodo indiretto
E’ necessario avere a disposizione molta proteina (metodo assoluto). A 280 nm qual è il contributo di ciascun aa all’Assorbanza totale? e Phe Tyr Trp cambia da proteina a proteina Non c’è solo un problema di composizione ma di interazione fra anelli aromatici diversi Se ci sono più Tyr e non è dato dalla somma, dipende dalla posizione che occupano sulla catena. Metodo indiretto Ad es. Bradford sono metodi relativi Blu di Comassie legato alla proteina è blu se non è legato è marroncino. A 595 nm si misura l’Assorbanza del complesso PD e non D.

19 METODI INDIRETTI P + C PC
Molto spesso non è importante sapere la quantità assoluta, ma avere un metodo riproducibile che sia sensibile e che permetta di valutare la quantità in maniera relativa (avendo a disposizione uno standard). Blu di Comassie si lega alle proteine, ma a tutte in egual misura? P + C PC L’equilibrio deve essere tutto spostato a destra Deve essere completa, bisogna usare cioè un largo eccesso di colorante. Riassumendo: 1) la quantità che si lega deve essere la stessa per tutte le proteine; 2) la reazione deve essere completa; 3) il colorante libero non deve assorbire.

20 Metodo di Lowry sensibilità: qtà inferiori a 10 mg/ml
Quando si mescola alla soluzione proteica il reagente di Folin (tungstato, molibdato e fosfato di sodio) ed una soluzione di solfato di rame si sviluppa un colore blu-porpora che può essere letto a 600 nm. Tris e tamponi zwitterionici (PIPES, HEPES) interferiscono. Il colore sviluppato dipende dal contenuto di tirosina e triptofano. Reaction schematic for the Modified Lowry Protein Assay.

21 Metodi dell’acido bicinconinico (BCA).
Simile al Lowry, dipende dalla conversione di Cu++ in Cu+ in condizioni alcaline che viene poi rilevato mediante reazione con il BCA per ottenere un color porpora letto a 562 nm. E’ più sensibile rispetto al Lowry (qtà inferiori a 0.5mg/ml) e più tollerante per la presenza di altri composti.

22 Bradford Protein Assay
The Bradford assay is a protein determination method that involves the binding of Coomassie Brilliant Blue G-250 dye to proteins. The dye exists in three forms: cationic(red), neutral (green), and anionic (blue). Under acidic conditions, the dye is predominantly in the doubly protonated red cationic form (Amax = 470 nm). However, when the dye binds to protein, it is converted to a stable unprotonated blue form (Amax = 595 nm). It is this blue protein-dye form that is detected at 595 nm in the assay using a spectrophotometer or microplate reader.

23 Work with synthetic polyamino acids indicates that Coomassie Brilliant Blue G-250 dye binds primarily to basic (especially arginine) and aromatic amino acid residues. The extinction coefficient of a dye-albumin complex solution is constant over a 10-fold concentration range. Thus, Beer's law may be applied for quantitation of protein. Certain chemical-protein and chemical-dye interactions interfere with the assay. Interference from non-protein compounds is due to their ability to shift the equilibrium levels of the dye among the three colored species.

24 Selezione della proteina standard
La proteina ideale da usare come standard è la forma assolutamente pura della proteina da dosare. In assenza di tale proteina si può usare un’altra proteina come standard relativo. Il miglior standard relativo deve dare una colorazione simile a quella della proteina da saggiare. Le proteine più usate come standars sono il BSA e la gamma-globulina

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26 2) Spettroscopia a raggi gamma
Raggi gamma sono di origine nucleare, ad alta energia e quindi alto potere penetrante. Una importante applicazione dell’emissione a raggi gamma e’ l’uso di un elemento Tc (tecnezio). Non e’ un elemento naturale ma prodotto dall’industria nucleare. Tc è utile per studi medici perche’ se complessato con una sostanza si concentra in alcuni tessuti (ossa, fegato, cervello) e può essere individuato grazie al suo spettro di emissione. 3) Spettroscopia a raggi X Raggi X: a differenza dei gamma originano dagli elettroni, possono essere assorbiti dalla materia e questo produce spettri di emissione a raggi X. Si applicano regole simili alla legge di Lambert e Beer. Applicazioni in campo forense e studi di inquinamento ambientale perche’ permette di rivelare molti elementi e le loro concentrazioni.

27 4) Luminometria STRUMENTAZIONE
Luminescenza: emissione di radiazione elettromagnetica nella regione visibile come risultato di una reazione chimica. Luminometria: la tecnica usata per misurare la luminescenza. Chemioluminescenza: come risultato di una reazione chimica (ad es. luminolo reagisce con ossigeno e dà chemioluminescenza). Bioluminescenza: viene emessa della luce in seguito ad una reazione catalizzata da un enzima (di solito luciferasi). La lunghezza d’onda emessa dipende dal substrato usato e varia da 560 nm (giallo verde) a 620 nm (rosso). Il metodo e’ estremamente sensibile. STRUMENTAZIONE Non c’è necessità di un monocromatore. 1. Bisogna amplificare il segnale prima di registrarlo, viene infatti raccolto da un fotomoltiplicatore collegato ad un amplificatore di corrente. 2. Controllare la T.

28 APPLICAZIONI Il sistema della luciferasi di lucciola.
luciferina + ATP + O ossiluciferina + AMP + PPi + CO2 + luce 1. Misurazione dell’ATP 2. Utilizzo del luminolo (e derivati) come substrati di reazioni. 3. Misurazione della luciferasi come gene “reporter”. luciferasi

29 1. Misurazione dell’ATP

30 2. Utilizzo del luminolo (e derivati) come substrati di reazioni.
Il luminolo assieme all’enzima microperossidasi può costituire la base del dosaggio di molti enzimi tra cui l’acetilcolinesterasi (ACE), coinvolta nella trasmissione sinaptica: acetilcolina acido acetico + colina colina + O2 + H2O betaina + 2H2O2 H2O2 + luminolo acido aminoftalico + N2 + luce ACE colina ossidasi microperossidasi

31 3. Misurazione della luciferasi come gene “reporter”.

32 5) Spettrofluorimetria
La fluorescenza è un fenomeno di emissione. La transizione di energia da uno stato più alto ad uno più basso è accompagnata da una emissione di radiazione piuttosto che assorbimento. Affinchè ciò avvenga deve prima avvenire un evento di eccitazione, ad es. causato da assorbimento di radiazione elettromagnetica. La l della radiazione di assorbimento deve essere più bassa (energia più alta) di quella emessa (fluorescenza). La differenza di queste due l è nota come “shift di stokes”. E’ possibile per un composto assorbire (o essere eccitato) nel UV ed emettere (o fluorescere) nel visibile. Fosforescenza, simile ma l’emissione ha un tempo di decadi- mento più lungo e persiste anche quando l’eccitazione è terminata. L’emissione della luce avviene a l maggiori della fluorescenza.

33 Il meccanismo di diseccitazione con emissione di un fotone è quello che accade in fluorescenza.
Le proteine sono macromolecole facimente studiabili con la tecnica della spettrofluorimetria in cui la lunghezza d'onda dell'energia emessa è maggiore della lunghezza d'onda dell'energia assorbita. L’aumento di lunghezza d'onda è chiamato spostamento o shift di Stokes. Poiché un quanto è pari all'energia necessaria per permettere il salto di un elettrone, l'efficienza quantica Q è il rapporto tra i quanti emessi per fluorescenza e i quanti assorbiti ed è indipendente dalla lunghezza d'onda della luce di eccitamento. A basse concentrazioni, vale la relazione seguente tra l'intensità di fluorescenza If e la radiazione incidente Io: If  = Io 2,3 e l c d Q dove c=concentrazione molare del composto fluorescente;         d=cammino ottico, in cm, della soluzione fluorescente;         e= coefficiente di estinzione molare del composto che assorbe alla lunghezza d'onda l

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35 La tecnica della spettrofluorimetria è accurata a basse
concentrazioni dove la spettrofotometria non lo è. 100 pg catecolamine spettrofluorimetria 100 mg catecolamine spettroscopia Selettività spettrale Strumentazione: due monocromatori controllo T E’ influenzata dal pH, temperatura, polarità del solvente ma soprattutto dal “quenching” -----> la luce emessa viene persa per collisione con altre molecole ====> bassa concentrazione

36 Applicazioni Molte anche se pochi composti manifestano questo fenomeno. Il rilevamento di un composto non fluorescente può essere ottenuto legandolo ad un probe fluorescente (fluorescenza estrinseca). Se invece il composto nativo ha fluorescenza (fluorescenza intrinseca). aa legati tramite il gruppo -NH2 a cloruro di dansile acridina orange dà coniugati diversi con DNA ss e ds. L’utilizzo maggiore è la determinazione di sostanze presenti in scarsa quantità: vitamina B1 nel cibo, NADH, ormoni, droghe, pesticidi, carcinogeni,…..

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38 Abbiamo spettri caratteristici dello stato folded che unfolded
Spettrofluorimetria e studio del folding di una proteina La fluorescenza è diversa a seconda dell’ambiente più o meno polare dell’ambiente proteico in cui si trovano e risente dell’effetto quenching creato dall’interazione con altre molecole o altre struttura chimiche delle proteine (ponti disolfuro) Le fluorescenze sono diverse a seconda che conservino la struttura terziaria o no La denaturazione comporta un allungamento dello shift di Stokes e del cambiamento di intensità dello spettro di emissione Abbiamo spettri caratteristici dello stato folded che unfolded E’ possibile calcolare la % di proteina nei due stati

39 fu = (yf - y) / (yf - yu) fu: frazione unfolded; yf : fluorescenza della proteina folded; yu: fluorescenza della proteina unfolded Y: fluorescenza del campione ad una particolare concentrazione di denaturante

40 5. Separatore di cellule a fluorescenza (FACS)

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47 515 nm 580 nm 650 nm

48 Analisi citofluorimetrica dei leucociti del sangue periferico
Analisi citofluorimetrica dei leucociti del sangue periferico. Si noti come si possono facilmente identificare tre popolazioni, ovvero i linfociti, monociti e granulociti, ed eventualmente disegnarci intorno un “gate” elettronico che permetterà in seguito l’analisi del segnale di fluorescenza proveniente soltanto dalla popolazione scelta.

49 Lo studio dei parametri fisici applicato a nuclei isolati (provenienti da cellule trattate con
una soluzione ipotonica) permette anche di discriminare immediatamente cellule normali da cellule apoptotiche, i cui nuclei sono infatti condensati e raggrinziti, ovvero diminuisco- no il FSC ed aumentano il SSC.

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51 Spettroscopia in dicroismo circolare (CD)
Questo tipo di spettroscopia sfrutta la capacità degli isomeri ottici di ruotare il piano della luce polarizzata. La luce può essere polarizzata in modo da selezionare le onde elettromagnetiche che oscillano su uno stesso piano mediante il passaggio della luce attraverso uno schermo polarizzante o un prisma di Nicol. La radiazione polarizzata in un piano corrisponde alla sovrapposizione di onde polarizzate circolarmente a destra e a sinistra della stessa intensità.

52 Se le due onde polarizzate circolarmente
a destra e a sinistra hanno intensità diversa, la radiazione derivante dalla loro somma è polarizzata ellitticamente. Questa tecnica permette di misurare la variazione dell'angolo di polarizzazione dopo che la luce ha attraversato una sostanza chirale (otticamente attiva). Entrando in un materiale che assorbe differentemente la radiazione circolarmente polarizzata a destra e quella circolarmente polarizzata a sinistra, la luce incidente, polarizzata nel piano, esce polarizzata ellitticamente. L'ellitticità q è il parametro che viene misurato nella spettroscopia CD ed è dato da: q = DE (180/4 p) = 33 DE gradi     DE è dato dalla differenza tra le componenti R ed L.

53 APPLICAZIONI La principale è lo studio della conformazione delle macromolecole biologiche che si integra con dati di NMR. PROTEINE Si possono avere informazioni sulla proporzione relativa delle strutture secondarie (a eliche, foglietti b) presenti in una proteina in soluzione. Nelle regioni del cosiddetto near UV si possono identificare picchi che derivano dal contributo alla rotazione della luce polarizzata fornito da residui di triptofano (intorno a 290 nm) di Phe e Tyr intorno a 280 nm e del disolfuro intorno a 270 nm. - Determinazione della struttura secondaria di una proteina Studio dell’effetto del legame di farmaci sulle proteine Folding /denaturazione delle proteine Studio di interazione proteina-proteina e proteina-DNA

54 Il segnale CD di una proteina dipende dalla sua struttura secondaria

55 Gli spettri CD possono essere interessanti per:
- distinguere B, A e Z DNA; - studiare variazioni della struttura causate da modificazione del pH, della forza ionica o anche dall'interazione con DNA binding proteins. Circular dichroism spectroscopy of HMGI-C binding to DNA. Near-UV CD spectrum of 2 mM double-stranded CAnt1 oligonucleotide +/- 2 mM HMGI-C (1:1 molar ratio). The ellipticity values are given in terms of the molar concentration of oligonucleotides. The solid line represents the oligonucleotide alone, while the dashed line represents the oligonucleotide plus protein.

56 7. Turbidometria e nefelometria
Utilizzate per determinare la concentrazione di sospensioni diluite. Nella turbidometria viene misurato l’assorbimento apparente della radiazione quando attraversa la sospensione. La legge di Lambert e Beer non è applicabile . Non avviene assorbimento ma fenomeni di dispersione in cui la luce è diffratta dalle particelle sospese. Si usa sempre lo spettrofotometro. APPLICAZIONI Misura di sospensioni di microrganismi (batteri, lievito) lettura a 600 nm.