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PubblicatoVanna Carella Modificato 11 anni fa
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Enzimi di restrizione riconoscono sequenze specifiche, in genere di 4-6 nucleotidi, di DNA a doppio filamento. Queste sequenze sono generalmente palindromi, cioè identiche se lette in direzione 5'--> 3' sia su un filamento che sull'altro.
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-Servono a tagliare il DNA in modo preciso e prevedibile
-Sono stati isolati più di 1200 enzimi da procarioti -Riconoscono più di 130 diverse sequenze nucleotidiche (sequenze palindromiche di 4, 6 o 8 nucleotidi). Il nome deriva dal batterio da cui è stato isolato: EcoRI E = genere Escherichia co = specie coli GAATTC R = ceppo RY13 CTTAAG I = prima endonucleasi isolata BamHI B = genere Bacillus am = specie amyloliquefaciens GGATCC H = ceppo H CCTAGG I = prima endonucleasi isolata Simmetria binaria
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Tipi di taglio -BLUNT ENDS O TAGLIO NETTO Es. SmaI
5’-CCC GGG-3’ 5’-CCC-3’ ’- GGG-3’ 3’-GGG CCC-5’ ’-GGG-5’ ’-CCC-5’ -STICKY ENDS O CODINE ADESIVE: -5’ PROTRUDING (5’ SPORGENTE) -3’ PROTRUDING (3’ SPORGENTE) Es. Eco RI (5’ PROTRUDING) 5’-G/AATTC-3’ 5’-G-3’ ’-AATTC-3’ 3’-CTTAA/G-5’ 3’-CTTAA-5’ ’-G-5’ Es. Kpn I (3’ PROTRUDING) 5’-GGTAC/C-3’ 5’-GGTAC -3’ ’-C-3’ 3’-C/CATGG-5’ 3’-C-5’ 3’-CATGG-5’
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Quante volte taglia un enzima
Probabilità di trovare un sito di restrizione: basi probabilità 4 (1/4)4 = 1/256 5 (1/4)5 = 1/1024 6 (1/4)6 = 1/4096 8 (1/4)8 = 1/65536
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DNA ligasi
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defosforilazione
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Gel elettroforesi
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Southern blot Il Southern Blot è una tecnica che permette di identificare la presenza del frammento di DNA che a noi interessa tra una miscela di tantissimi frammenti.
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Chimica del DNA Soluzione viscosa a pH 7
Diminuzione viscosità a pH estremi o a T> 80°C Denaturazione ( aumento D.O) Rinaturazione (diminuzione D.O.) Formazione di ibridi anche tra catene di specie diverse I nucleotidi vanno incontro a trasformazioni chimiche (mutazioni)
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DENATURAZIONE E RINATURAZIONE
La denaturazione del DNA consiste nella separazione completa dei due filamenti complementari che lo costituiscono. Il processo inverso è detto rinaturazione.
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ANALISI FISICA Effetto ipercromico:
Grado di denaturazione (%) 50 1.3 1.2 1.1 1.0 Temperatura (°C) Assorbanza a 260 nm Tm Curva di fusione Effetto ipercromico: Aumento dell’A260nm durante il processo di denaturazione del DNA. Temperatura di melting (Tm): Temperatura in corrispondenza della quale il DNA è denaturato al 50%. Maggiore è G+C, maggiore è Tm.
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CINETICA di RINATURAZIONE
Log Cot Rinaturazione (%) DNA a rinaturazione rapida 50 100 Curva C0t lenta Effetto ipocromico: Diminuzione dell’A260nm durante il processo di rinaturazione del DNA. Parametri che influenzano la rinaturazione: 1) C Concentrazione espressa in nucleotidi/unità di volume 2) Tempo La misura della velocità di rinaturazione può fornire utili informazioni circa la complessità del DNA
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forma A forma B forma Z Senso elica destrorsa destrorsa sinistrorsa Diametro 26 A 20 A 12 A Coppie di basi per ogni giro di elica Distanza tra basi 2.6 A 3.4 A 3.7 A Piegamento basi rispetto all’asse dell’elica 20° 6° 7° Conformazione dello zucchero C-3’ endo C-2’ endo C-2’ endo per pirimidine C-3’ endo per purine Legame glucosidico anti anti anti per pirimidine sin per purine
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Cot Fig. 13 Curva di Cot % ss DNA rimanente
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SONDE E MARCATURA La sonda è un frammento specifico di DNA (o RNA), reso radioattivo, capace di riconoscere una sequenza complementare di DNA o RNA in una popolazione di tanti frammenti.
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Metodi di marcatura Nick transaltion Random priming
Marcatura terminale
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5’P -3’OH 3’OH -5P’ nick con un -OH disponibile L’attività 3’5’ esonucleasica rimuove il nucleotide L’attività 5’3’ polimerasica sostituisce il nucleotide L’attività 5’3’ esonucleasica sposta il nick verso il 3’
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Denaturazione ed appaiamento degli esanucleotidi casuali
-3’OH 5’P 3’OH -5P’ Denaturazione ed appaiamento degli esanucleotidi casuali 3’P 5’OH Enzima Klenow + dNTP*
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Metodo dell’innesco casuale Spostamento dell’incisione
MARCATURA delle SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE RANDOM PRIMING Metodo dell’innesco casuale NICK TRANSLATION Spostamento dell’incisione -3’ 3’- -5’ 5’- DNA denaturazione aggiunta di inneschi esanucleotidici 3’-GCATGC-5’ 5’-TGCAGT-3’ 5’-GCATAC-3’ 3’-TAGCAG-5’ ibridizzazazione Frammento di Klenow, dNTP dATP 32P-dCTP dTTP dGTP Sintesi DNA DNA sonda marcato riempimento del buco prodotto con un nucleotide radioattivo e rimozione del nucleotide successivo -3’ 3’- -5’ 5’- DNA G C G C A A G C G C G T T C G G C A A G G C C A A G G C G A A G G C G C A G 32P-dCTP dGTP il taglio si muove in direzione 5’-3’ taglio di un’elica e rimozione di un nucleotide mediante la DNA polimerasi I Pol I 3’- -5’
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Trattamento con fosfatasi
3’OH -5P’ 5’P -3’OH Trattamento con fosfatasi -5’OH 5’OH Polinucleotide chinasi+ [32P]dATP
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I tipi di marcatura non radioattiva sono essenzialmente:
-marcatura isotopica diretta (incorporazione di nucleotidi modificati conteneti un fluorocromo, cioè un gruppo chimico in grado di emettere fluorescenza se esposto alla luce di una certa l); -marcatura indiretta ( associazione tra una molecola indicatrice e un precursore nucleotidico). I sistemi più usati sono: -Il sistema biotina-streptavidina -La digossigenina
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Affinità molto elevate tra Biotina e Avidina o Streptavidina
HN O N dUTP Uracile Desossiribosio Trifosfato S NH Biotina C U C G A G A U G U C A U G A G C T C T A C A G T A B DNA sonda DNA target A U G U C T A C A G E A F Ibridazione del DNA sonda col DNA bersaglio dei cromosomi (A) Avidina-enzima (B) Avidina-fluoroforo PRINCIPIO DELLE SONDE NON RADIOATTIVE: Affinità molto elevate tra Biotina e Avidina o Streptavidina E = molecole reporter fosfatasi alcalina o b-galattossidasi F = molecole reporter
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Ibridazione L’ibridazione è quel processo per cui due filamenti di DNA (o RNA) possono appaiarsi e formare un ibrido (doppia elica) più o meno stabile mediante la formazione di legame idrogeno per un certo numero di basi complementari. L’ibrido può formarsi tra DNA/DNA e DNA/RNA. L’ibridazione può avvenire anche tra molecole di DNA non perfettamente complementari. Sono molto importanti le condizioni sperimentali.
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Condizioni stringenti
Vengono definite condizioni stringenti, quelle condizioni sperimentali che permettono la migliore ibridazione. Condizioni di ibridazione piu’ stringenti (richiedono maggiore percentuale di omologia tra sonda e bersaglio): maggiore Temperatura minore concentrazione salina presenza di denaturanti chimici Condizioni di ibridazione meno stringenti (permettono minore percentuale di omologia tra sonda e bersaglio): minore Temperatura maggiore concentrazione salina assenza di denaturanti chimici
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Mappe di restrizione in diagnostica
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...MAPPATURA di RESTRIZIONE
6 2 1 A B TRATTAMENTO DIMENSIONE dei FRAMMENTI (Kb) INTERPRETAZIONE Nessuna digestione Enzima A Enzima B Enzima A+ B 9 7 3 4 2 + 7 3 + 6
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ripetizione: adenina e citosina acacacacacacacacacacacacacacac
Sequenziamento con isotopi radioattivi a = adenina c = citosina g = guanina t = timina g t a c g t a c g t a c g t a c MICROSATELLITE ripetizione: adenina e citosina acacacacacacacacacacacacacacac dinucleotide :(ac)15
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Polymerase Chain Reaction
1) ESTRAZIONE DEL DNA Sangue Peli Seme DNA Doppia Elica 2) PCR Polymerase Chain Reaction Individuo A Individuo B Individuo C campione di controllo 3 paia di cromosomi omologhi 3) ELETTROFORESI
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di un campione con 12 microsatelliti Immagine Computerizzata
Sequenziatore Automatico Elettroferogramma di un campione con 12 microsatelliti Immagine Computerizzata dell’ elettroforesi GENOTIPO: 263/263 PADRE MADRE GENOTIPO: 263/277 DIAGNOSI POSITIVA FIGLIO GENOTIPO: 263/263 Profilo genetico di un campione FIGLIO GENOTIPO: 263/277
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PADRE PADRE MADRE MADRE FIGLIO FIGLIO FIGLIO FIGLIO FIGLIO
GENOTIPO: 128/140 PADRE GENOTIPO: 263/263 128 140 263 GENOTIPO: 128/146 GENOTIPO: 263/277 MADRE MADRE 128 146 263 277 FIGLIO GENOTIPO: 128/128 GENOTIPO: 263/263 128 FIGLIO 263 FIGLIO GENOTIPO: 124/128 124 GENOTIPO: 263/277 128 FIGLIO FIGLIO 263 277 GENOTIPO: 128/128 128 DIAGNOSI POSITIVA DIAGNOSI NEGATIVA
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