Clonaggio funzionale Clonaggio posizionale

Presentazione sul tema: "Clonaggio funzionale Clonaggio posizionale"— Transcript della presentazione:

1 Clonaggio funzionale Clonaggio posizionale
Conoscenza proteina Malattia genetica Determinazione sequenza amminoac. Mappatura genetica con marcatori polimorfici Deduzione sequenza nucleotidica Identificazione cloni genomici che coprono il sito mappato Sintesi sonda oligonucleotidica Ricerca del gene (varie tecniche) Isolamento clone di cDNA Deduzione della struttura aminoac. Isolamento clone genomico Ricerca mutazioni nucleotidiche Caratterizzazione clone genomico Ricerca funzione proteica Ricerca delle mutazioni

2 METODI DI CLONAGGIO

3 CLONAGGIO ATTRAVERSO VETTORE

4 ENZIMI DI RESTRIZIONE

5 DIGESTIONE MULTIPLA E CLONAGGIO

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7 Numero di cloni necessario per costruire librerie genomiche
N = ln (1 – P) / ln (1- a/b) a = dimensione media del frammento b = totale del genoma da clonare P = frammento qualunque sia clonato Specie Dimensioni del genoma (bp) Numero di cloni Frammenti Frammenti da 17 kb da 35 kb E. coli 4,6 x 106 820 410 S. cerevisiae 1,8 x 107 3225 1500 D. melanogaster 1,2 x 108 21500 10000 Riso 5,7 x 108 100000 49000 Uomo 3,2 x 109 564000 274000 Rana 2,3 x 1010

8 MAPPATURA FISICA COSTRUZIONE DI LIBRERIE GENOMICHE A PARTIRE DA DNA OTTENUTO DA: DNA GENOMICO TOTALE IBRIDI SOMATICO-CELLULARI PANNELLI DI IBRIDI MONOCROMOSOMICI PANNELLI DI IBRIDI CON CROMOSOMI DELETI IBRIDI DA RADIAZIONE SINGOLI CROMOSOMI ISOLATI CON CITOMETRIA A FLUSSO

9 STIMA DELLA RELAZIONE TRA DISTANZA GENETICA E FISICA
Stima della distanza genetica totale (in cM) nella specie umana: somma della lunghezza totale dei cromosomi ottenuta dalla mappatura genetica con marcatori polimorfici Nel maschio = 2644 cM Nella femmina = 4481 cM Per 3000 Mb = 3 x 10 9 bp di genoma Maschio cM = 1.13 Mb = 1.13 x 106 bp Femmina cM = 0.67 Mb = 0.67 x 106 bp Media : 1 cM = 0.9 Mb = 0.9 x 106 bp

10 SEPARAZIONE DI CROMOSOMI CON CITOMETRIA A FLUSSO

11 VETTORI DI CLONAGGIO DIMENSIONI DELL’INSERTO
GENOMA UMANO VETTORI DI CLONAGGIO DIMENSIONI DELL’INSERTO Vettori plasmidici standard Kb Vettori lambda Kb Vettori cosmidici Kb Vettori BAC (cromosomi artificiali batterici) fino a 300 Kb Vettori YAC (cromosomi artificiali di lievito) Mb Libreria di DNA genomico in termini di genoma-equivalenti 1 genoma equivalente: 3000 Mb/40 Kb = cloni indipendenti

12 ASSEMBLAGGIO DEI CLONI IN CONTIGUI ATTRAVERSO:
1) walking cromosomico: - con cloni interi (e soppressione di sequenze ripetitive); - con le estremità dei cloni 2) fingerprinting per identità di: - mappa di frammenti di restrizione - presenza DNA ripetitivo in frammenti di restrizione, - prodotti PCR compresi tra elementi ripetuti (IRE, intersperse repetitive elements, es. Alu), 3) contenuto di Sequence Tagged Site (STS) (Siti contrassegnati da una sequenza)

13 DIGESTIONE PARZIALE DEL DNA E PRODUZIONE DI CLONI CON FRAMMENTI CHE SI SOVRAPPONGONO

14 CHROMOSOME WALKING

15 METODI PER L’ANALISI DEI CLONI GENOMICI PER ORDINARLI
IN CONTIGUI - Distribuzione dei cloni in piastre da microtitolazione per produrre griglie ordinate - Produzione di filtri con i singoli cloni da utilizzare per analisi con ibridazione - Produzione di pool di DNA di cloni e selezione attraverso PCR specifiche

16 - Piastra agar con cloni ricombinanti
-Trasferimento delle singole colonie in piastre da microtitolazione con pozzetti con terreno (96 pozzetti per microtiter) Produzione filtro corrispondente

17 Libreria specifica del cromosoma 6 con cloni ordinati su griglia
- Piastra di agar 22 x 22 cm con cloni ricombinanti Trasferimento delle singole colonie in piastre di microtitolazione con pozzetti con terreno (96 pozzetti per microtiter) - Trasferimento delle singole colonie in piastre da microtitolazione ad alta densità 96 x 4 = 384 pozzetti per microtiter - Trasferimento automatizzato su filtro 54 microtiter x 384 pozzetti = cloni = 4 genomi equivalenti

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19 ASSEMBLAGGIO DEI CLONI IN CONTIGUI ATTRAVERSO:
1) walking cromosomico: - con cloni interi (e soppressione di sequenze ripetitive); - con le estremità dei cloni 2) fingerprinting per identità di: - mappa di frammenti di restrizione - presenza DNA ripetitivo in frammenti di restrizione, - prodotti PCR compresi tra elementi ripetuti (IRE, intersperse repetitive elements, es. Alu), 3) contenuto di Sequence Tagged Site (STS) (Siti contrassegnati da una sequenza)

20 FINGERPRINTING PER MAPPA DI FRAMMENTI DI RESTRIZIONE
Presenza nei diversi cloni di frammenti di restrizione della stessa dimensione

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22 FINGERPRINTING DEI CLONI PER PRESENZA DI DNA RIPETITIVO
IRE = elementi ripetuti intercalati, es sequenze Alu: inter Alu-PCR

23 ASSEMBLAGGIO DI CLONI MEDIANTE ANALISI DEL CONTENUTO DI
SEQUENCE TAGGED SITE (STS) (SITI ETICHETTATI DA UNA SEQUENZA) STS = sequenza a singola copia amplificabile con PCR La presenza del prodotto PCR di peso molecolare atteso rivela la presenza di quella STS all’interno di un clone

24 ALLINEAMENTO DI YAC PER CONTENUTO DI STS

25 ALLINEAMENTO DI YAC PER CONTENUTO DI STS

26 Screening di intere librerie genomiche con PCR su pool di DNA

27 PREPARAZIONE DI POOL DI DNA DI CLONI YAC E SCREENING CON PCR

28 CLONAGGIO POSIZIONALE:
UTILIZZO DEI MARCATORI ASSOCIATI GENETICAMENTE PER COSTRUZIONE DI UN CONTIGUO DI CLONI GENOMICI