Amplificazione DNA Clonaggio PCR.

Presentazione sul tema: "Amplificazione DNA Clonaggio PCR."— Transcript della presentazione:

1 Amplificazione DNA Clonaggio PCR

2 Vettori di clonaggio Plasmidi Virus Trasposoni
Minicromosomi artificiali

3 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

4 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

5 sito di restrizione Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

6 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

7 Gli enzimi di restrizione possono generare diversi tipi di estremità

8 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

9 Uso degli enzimi di restrizione
Clonaggio Mappa di restrizione Polimorfismi di restrizione (RFLP)

10 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

11 Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

12 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

13 Vettori plasmidici

14 Elementi di un vettore plasmidico
Origine di replicazione Marcatore di selezione Sito di restrizione unico

15 Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

16 Preparazione del DNA da clonare
Digestione clone già esistente DNA specifico PCR frammentato con enzimi di restriz. Frammento di DNA genomico che può contenere regioni trascritte o non trascritte frammentazione meccanica Collezione DNA (banca, genoteca) cDNA: DNA ottenuto per trascrizione inversa dell’mRNA, che quindi contiene tutto o parte di una regione trascritta

17 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

18 PREPARAZIONE del cDNA RNA DNA
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

19 Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

20 Inserzione di un frammento di DNA in un vettore circolare
mediante ligasi di estremità coesive VETTORE  GAATTC CTTAAG  G CTTAA AATTC EcoRI  GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G CTTAA EcoRI INSERTO

21 Unione, mediante ligasi,
di estremità coesive create da un enzima di restrizione GAATTC CTTAAG VETTORE GAATTC CTTAAG G CTTAA AATTC EcoRI G CTTAA AATTC INSERTO GAATTC CTTAAG DNA ligasi

22 Reazione di ligasi strategie controlli

23 Inserzione di un frammento di DNA in un vettore circolare
mediante ligasi di estremità coesive VETTORE  GAATTC CTTAAG  G CTTAA AATTC EcoRI  GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G CTTAA EcoRI INSERTO

24 Clonaggio con singola digestione trattamento del vettore con fosfatasi
 G CTTAAp pAATTC  G CTTAA AATTC fosfatasi  G AATTC CTTAApG GpAATTC CTTAA G DNA ligasi pAATTC G CTTAAp EcoRI  GAATTC CTTAAG

25 Clonaggio con doppia digestione
EcoRI HindIII  GAATTC CTTAAG  AAGCTT TTCGAA  G CTTAA AGCTT A  AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G A TTCGA EcoRI HindIII  GAATTC CTTAAG  AAGCTT TTCGAA

26 Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

27 Introduzione del DNA nella cellula ospite
Trasformazione: CaCl2 Elettroporazione In E.coli Impacchettamento e infezione fagica Trasfezione (transiente o stabile): Calcio fosfato Liposomi In cellule di Elettroporazione eucarioti superiori Microiniezione DNA gun

28 Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

29 Vettori plasmidici

30 Strategie di selezione nel clonaggio
resistenza AMPICILLINA AMPICILLINA

31 Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

32 1200 bp SacI EcoRI

33 Isolamento acidi nucleici
lisi cellulare deproteinizzazione concentrazione

34 Analisi acidi nucleici
Spettrofotometro (quantitativa) Elettroforesi su gel (qualitativa, semiquantitativa)

35 1 OD260=50g/ml Spettro di assorbimento del DNA Assorbanza (OD)
220 240 260 280 300 320 0.5 1.0 1.5 lunghezza d’onda (nm) Assorbanza (OD) 1 OD260=50g/ml OD260/OD280=1,8-2,0

36 Elettroforesi di acidi nucleici
Gel di agarosio Gel di acrilammide

37

38 Elettroforesi su gel di agarosio

39 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

40 al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi.
Migrazione del DNA su gel Le molecole lineari di dsDNA migrano a velocità inversamente proporzionali al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi.

41 Fattori che influenzano la migrazione
Peso molecolare Concentrazione di agarosio Conformazione DNA Voltaggio applicato Intercalanti Tampone di elettroforesi

42 Visualizzazione del DNA

43 Marcatori di peso molecolare
 HindIII

44

45 Tecniche di trasferimento su membrana (Blotting)
Southern (blot) Northern (blot) Western (blot)

46 Agarosio o acrilammide
BLOTTING (TRASFERIMENTO) Molecole trasferite Sonda Gel Southern DNA DNA o RNA Agarosio o acrilammide Northern RNA Western Proteine Anticorpi Acrilammide

47 Metodi di trasferimento
Capillare Elettroblot

48

49 Assemblaggio del blot capillare
vaschetta carta 3MM carta 3MM } membrana nylon gel supporto tampone

50

51 Fattori che influenzano l’ibridazione
Temperatura Forza ionica pH

52