Editing dellRNA. Editing dellmRNA per la Apolipoproteina B umana.

Presentazione sul tema: "Editing dellRNA. Editing dellmRNA per la Apolipoproteina B umana."— Transcript della presentazione:

1 Editing dellRNA

2 Editing dellmRNA per la Apolipoproteina B umana

3 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

4 Editing dellmRNA per la subunità B di GluR

5 Editing inserzionale in Tripanosoma

6 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 Editing di coxIII (mitocondri di tripanosoma)

7 Editing inserzionale mediante RNA guida

8 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

9 Clonaggio PCR Amplificazione DNA

10 Vettori di clonaggio Plasmidi Virus Trasposoni Minicromosomi artificiali

11 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

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13 sito di restrizione

14 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

15 Gli enzimi di restrizione possono generare diversi tipi di estremità

16 Uso degli enzimi di restrizione Clonaggio Mappa di restrizione Polimorfismi di restrizione (RFLP)

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18 Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Scelta e preparazione del vettore Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

19 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

20 1.Origine di replicazione 2.Marcatore di selezione 3.Sito di restrizione unico Elementi di un vettore plasmidico

21 Vettori plasmidici

22 Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

23 Preparazione del DNA da clonare Frammento di DNA genomico che può contenere regioni trascritte o non trascritte cDNA: DNA ottenuto per trascrizione inversa dellmRNA, che quindi contiene tutto o parte di una regione trascritta frammentato con enzimi di restriz. frammentazione meccanica DNA specifico Collezione DNA (banca, genoteca) Digestione clone già esistente PCR

24 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 Collezioni di DNA clonato (banca cDNA, genoteca)

25 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 PREPARAZIONE del cDNA RNA DNA

26 Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

27 Unione, mediante ligasi, di estremità coesive create da un enzima di restrizione GAATTC CTTAAG G CTTAA AATTC G EcoRI GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG DNA ligasi GAATTC CTTAAG VETTORE G CTTAA AATTC G INSERTO

28 strategie controlli Reazione di ligasi

29 Inserzione di un frammento di DNA in un vettore circolare mediante ligasi di estremità coesive GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG G CTTAA AATTC G EcoRI GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G CTTAA EcoRI VETTORE INSERTO

30 trattamento del vettore con fosfatasi pAATTC G CTTAAp G AATTC CTTAApG GpAATTC CTTAA G DNA ligasi pAATTC G CTTAAp EcoRI G CTTAA AATTC G fosfatasi GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG Clonaggio con singola digestione

31 Clonaggio con doppia digestione GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG AAGCTT TTCGAA G CTTAA AGCTT A EcoRI AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G A TTCGA EcoRI HindIII AAGCTT TTCGAA HindIII

32 Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

33 Introduzione del DNA nella cellula ospite Trasformazione: CaCl2 Impacchettamento e infezione fagica In E.coli Elettroporazione In cellule di eucarioti superiori Trasfezione (transiente o stabile): Calcio fosfato Liposomi Elettroporazione Microiniezione DNA gun

34 Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

35 Vettori plasmidici

36 Strategie di selezione nel clonaggio AMPICILLINA resistenza

37 Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

38 1200 bp SacI EcoRI

39 1.lisi cellulare 2.deproteinizzazione 3.concentrazione Isolamento acidi nucleici

40 Spettrofotometro (quantitativa) Elettroforesi su gel (qualitativa, semiquantitativa) Analisi acidi nucleici

41 Spettro di assorbimento del DNA 220240260280300320 0.5 1.0 1.5 lunghezza donda (nm) Assorbanza (OD) 1 OD 260 =50 g/ml OD 260 /OD 280 =1,8-2,0

42 Elettroforesi di acidi nucleici Gel di agarosio Gel di acrilammide

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44 Elettroforesi su gel di agarosio

45 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

46 Migrazione del DNA su gel Le molecole lineari di dsDNA migrano a velocità inversamente proporzionali al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi.

47 Fattori che influenzano la migrazione Peso molecolare Concentrazione di agarosio Conformazione DNA Voltaggio applicato Intercalanti Tampone di elettroforesi

48 Visualizzazione del DNA

49 Marcatori di peso molecolare HindIII

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51 Tecniche di trasferimento su membrana (Blotting) Southern (blot) Northern (blot) Western (blot)

52 BLOTTING (TRASFERIMENTO) Molecole trasferite SondaGel SouthernDNA DNA o RNA Agarosio o acrilammide NorthernRNA DNA o RNA Agarosio o acrilammide WesternProteineAnticorpi Acrilammide

53 Metodi di trasferimento Capillare Elettroblot

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55 carta 3MM membrana nylon gel supporto } carta 3MM tampone vaschetta Assemblaggio del blot capillare

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57 Fattori che influenzano libridazione Temperatura Forza ionica pH

58 Esempio di Southern blot genomico

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60 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006