R R R R R Protocollo di binding (tipo 1) ([crescenti] di radioattivo

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1 R R R R R Protocollo di binding (tipo 1) ([crescenti] di radioattivo
+ tutti i non-specifici rispettivi

2 Binding R tessuto, membrane ligando radioattivo R R Separazione Filtrazione, centrifugazione R Quantificazione

3 Dati sperimentali Radioattivita’ legata in presenza di 10 µM di farmaco non radioattivo Radioattivita’ legata Concentrazione di Farmaco radioattivo Radioattivo: 100 Ci/mmol 50 µg/tubo

4 I due tipi di binding: tipo I e tipo II
Saturazione Competizione [X*] [X*] [3X*]

5 R R R R R R R R R R R Protocollo di binding (tipo 2)
Radioattivo fisso e [crescenti] di spiazzante non radioattivo Non specifico [R] R [R] + F R [R] + 10F [R] +1000F R R R R R R R R R Perche’ utilizzare questo protocollo???

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7 Esempio di binding (II)
CONCENTRAZIONE DI RADIOATTIVO COSTANTE; INCREMENTO DI SPIAZZANTE Curva di inibizione

8 A* + R AR B + R BR KA = [AR] [A][R] KB = [BR] [B][R] [AR] = KA[A][R] [BR] = KB[B][R] RT = [R] + [AR] + [BR] = [R] + KA[A][R] + KB[B][R] = [R](1+ KA[A] + KB[B]) RT KA[A]RT [R] = (1+ KA[A] + KB[B]) [AR] = (1+ KA[A] + KB[B]) KA[A] [AR] RT = (1+ KA[A] + KB[B])

9 [AR] RT KA[A]RT (1+ KA[A] + KB[B]) = IC50 0.5 KA = 1 + KB[B]* IC50 Se KA e KB sono uguali: KA = 1 IC50 - D*

10 Esempio di binding (II)
Legame a 0.1 nM di radioattivo N.S. Legame specifico: = 3000 D* = 0. 1 nM IC50 = 0.2 nM KA = 1 IC50 - D* DR [D*] K = A RT [*D] K + 1 A Una delle prime formule che abbiamo visto!! Possiamo usare questa formula perché Ka = Kb

11 L’NAADP e’ un possibile secondo messaggero. Per dimostrare
Proviamo L’NAADP e’ un possibile secondo messaggero. Per dimostrare che possiede recettori specifici intracellulari, e’ stato sintetizzato [32P]NAADP ad una attivita’ specifica di 800 Ci/mmol. Il binding e’ stato fatto con concentrazione fissa di [32P]NAADP (50 pM),100 µg di proteina e concentrazioni crescenti di NAADP. [NAADP] pM DPM

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13 IC50 = ( )/2 = 1200 quindi 500 pM Kd = = 450 pM Ka = Legame specifico = = 2400 DR RT [D*] K A [*D] + 1 = 2400 (50*10-12)*2.2*109 = dpm = RT (50*10-12)*2.2*109 + 1

14 In laboratorio vi viene chiesto, dietro compenso, di provare due
nuovi composti per valutarne l’affinita’ sui recettori muscarinici. Utilizzate 5 nM carbacolo radioattivo (attivita’ specifica 2 Ci/mmol) Che affinita’ hanno i due composti nel vostro preparato? In un ultimo esperimento provate A + B (entrambi 10 µM) e misurate 350 DPM legati.Cosa ne potete dedurre? Che altri esperimenti potete disegnare per caratterizzare i due composti?

15 IC50 = 20 nM IC50 = 1.5 nM IC50 = 100 nM e la Bmax??????? 1 1 + KB[B]*
KA = 1 IC50 - D* KA = 1 + KB[B]* IC50 IC50 = 20 nM IC50 = 1.5 nM IC50 = 100 nM e la Bmax???????

16 DR RT [D*] K A [*D] + 1 = DR = 2450 D* = 5 nM KA = M-1

17 Competizione su due siti (cosa potrebbe succedere)

18 Saturazione su due siti
DR D DR

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