Federica Camin Istituto Agrario di San Michele all’Adige (Trento)

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1 Federica Camin Istituto Agrario di San Michele all’Adige (Trento)
ANALISI DEI RAPPORTI TRA ISOTOPI STABILI DI BIOELEMENTI IN ALIMENTI (OLIO) Federica Camin Istituto Agrario di San Michele all’Adige (Trento)

2 Isotopo (iso+topos) = stesso posto
Esistono 9 tipi di ossigeno diverso (3stabili ) e gli altri instabili dal 12 al 20 Stabili (260) ISOTOPI (in totale circa 1700) Radioattivi

3 hanno lo stesso n° atomico (Z) ma un diverso n° di massa (A)
Isotopi di uno stesso elemento = hanno lo stesso n° di protoni (e quindi di elettroni) ma un diverso n° di neutroni hanno lo stesso n° atomico (Z) ma un diverso n° di massa (A) diversa massa

4 Frazionamento isotopico Effetto termodinamico
La variazione naturale di abbondanza isotopica nelle molecole è conseguenza delle diverse proprietà chimico-fisiche degli isotopi di uno stesso elemento. Massa differente Effetto cinetico Effetto termodinamico (Differente energia libera) (Differente velocità di reazione)

5 Abbondanza naturale % media Standard di riferimento internazionale
Rapporti isotopici normalmente indagati negli alimenti D/H, 13C/12C, 15N/14N, 18O/16O, 34S/32S Elemento Isotopo stabile Abbondanza naturale % media Standard di riferimento internazionale Idrogeno 1H 99.985 V-SMOW (Vienna –Standard Mean Ocean Water) 2H 0.015 Carbonio 12C 98.892 V-PDB (Vienna-Pee Dee Belemnite) Carbonato di calcio fossile 13C 1.108 Azoto 14N AIR (Azoto dell’aria) 15N 0.3663 Ossigeno 16O 17O 0.0375 18O 0.2039

6 Lo spettrometro di massa isotopica (IRMS):
misura di 13C/12C, 15N/14N, 18O/16O Accoppiamento dell’IRMS con l’analizzatore elementare L’IRMS viene normalmente accoppiato con un analizzatore elementare in quanto misura solo molecole semplici (CO2,N2,CO) R è il rapporto tra l’isotopo meno abbondante rispetto a quello più abbondante

7 Misura di D/H: Risonanza Magnetica Nucleare del D (SNIF 2H-NMR)
I = 1 => nucleo con distribuzione non simmetrica => breve T1 e T2 Bassa sensibilità (D poco abbondante e  <<) FT con impulso a 90° Solo molecole semplici (alcool, glicerina, acido acetico) Grandi quantità di campione (per alcool: 3 g) Sistema di lock, di solito alla frequenza del fluoro, per evitare drift del campo magnetico Disaccoppiamento del protone S/N > 150 (ca. 200 scansioni per spettro) 8 spettri per un tempo totale di ca. 4 ore Processore di dati spettrali dedicato

8 Misura di D/H: Risonanza Magnetica Nucleare del D (SNIF 2H-NMR)
Spettrometro a 9.4T (400 MHz) (Bruker, Karlsruhe, Germania) dotato di campionatore automatico e corredato di sonda specifica per l'osservazione del "deuterio" (61.4 MHz per B0=9.4T), avente un canale di disaccoppiamento del protone e un canale di stabilizzazione del campo magnetico (lock) alla frequenza del fluoro. (D/H)I CH2DCH2OH (D/H)II CH3CHDOH R = 2 (D/H)II / (D/H)I

9 Scala che illustra qualitativamente la composizione isotopica del carbonio di alcune sostanze naturali CO2 in zone boschive d13C = - 11 ‰ atm CO2 CO2 Tecnogenico d13C= - 30 ‰ piante C3 (vite, alberi da frutta, erba, olivo) -22‰ -33‰ piante C4 (canna, mais) -10‰ -15‰ piante CAM (vaniglia) Petrolio Gas naturali Carbonati - 80 - 70 - 60 - 50 - 40 - 30 - 20 - 10 d13C (‰) d13C (PDB)

10 PARAMETRI CHE INFLUENZANO IL RAPPORTO 15N/14N NEI COMPOSTI VEGETALI
Fissazione N2 atmosferico (0‰) -3/+1‰ (N2,NOx) Denitrificazione Residui organici (+10/+30 ‰) Precipitazioni Consumo da parte della pianta Materiale organico (R-NH2) -0,5‰ Ammonio (NH4+) Nitrati (NO3-) -12/-29‰ Minerali Nitrificazione ±1‰ Liscivamento

11 PARAMETRI CHE INFLUENZANO IL RAPPORTO D/H NEI COMPOSTI VEGETALI
Composizione isotopica dell'acqua di falda effetto latitudine ciclo planetario dell'acqua effetto geografico - continentale effetto altitudine effetto climatico Evapotraspirazione fogliare (temperatura - umidità relativa) bietola, fragola ( 91 ÷ 93 ppm ) piante a ciclo C 3 mele, pere, ciliegie ecc ( 96 ÷ 108 ppm ) ( 95 ÷ 101 ppm ) Provenienza vegetale del l’alcool vite ( 98 ÷ 108 ppm ) piante a ciclo C (canna da zucchero, mais) 4 ( 110 ÷ 115 ppm )

12 FATTORI CHE INFLUENZANO I RAPPORTI ISOTOPICI DEI PRODOTTI ANIMALI
I rapporti isotopici dei prodotti animali dipendono dal tipo di alimentazione e dall’origine dell’acqua L’ape assume gli zuccheri presenti nel nettare e li elabora senza alternarne i rapporti isotopici.

13 CHE INFORMAZIONI DANNO I RAPPORTI ISOTOPICI ?
tipo di isotopo è influenzato da…. e può perciò determinare… Metabolismo (C3, C4, CAM) Aggiunta illecita di zucchero di canna e/o barbabietola (ad esempio a vino e succhi di frutta) Tenore di mais nella dieta animale 13C/12C, D/H 18O/16O, D/H Origine dell’acqua Annacquamento (ad es. nel vino) Aggiunta di sostanze di sintesi 13C/12C , D/H Sintesi chimica 18O/16O, D/H, 15N14N, 13C/12C Caratterizzazione di prodotti ad origine protetta e controllata Origine geografica

14 Analisi dei rapporti tra isotopi stabili di bioelementi (D/H, 13C/12C, 15N/14N, 18O/16O, 34S/32S)

15 Possibili applicazioni delle analisi isotopiche agli oli d’oliva
Identificazioni di sofisticazioni con oli di altre specie vegetali o con oli di sintesi Identificazioni di sofisticazioni con oli di provenienza geografica diversa rispetto a quella dichiarata (oli DOP)

16 Stato applicativo delle analisi isotopiche nel settore degli oli
Gaffney et al., 1979, Rossel, d13C di diversi tipi di oli: mais (ca. –12‰), girasole (ca. -27‰), soia (ca. – 28‰), palma (ca. – 27‰), cocco (ca. –25‰) ed arachidi (ca. –28‰) Bianchi et al., d13C di oli di diverse cultivar di olive d13C olio d’oliva: -27,18/-28,57‰ d 13C non dipende dalla varietà delle olive, né dal loro grado di maturazione Angerosa et al., d13C su olio, frazione sterolica e alcoli alifatici, d18O su olio Distinzione tra Stati Meditterranei (Spagna, Italia, Marocco, Tunisia) Accenni di discriminazione tra zone Italiane, areali marini e areali interni Zhang et al., D/H su glicerolo con SNIF-NMR

17 OLI D’OLIVA A DOP Normative di riferimento:
- in ambito nazionale, la legge n. 169 del che ha sancito l'istituzione della DOC degli oli di tal tipo - in ambito comunitario, il Reg. CEE n. 2081/92 che offre la possibilità di estendere la tutela giuridica offerta dalla legge nazionale sulle DOC all'intero territorio della UE secondo le modalità della DOP e dell'indicazione geografica protetta (IGP). Requisiti minimi che deve possedere il disciplinare di produzione per una DOP la delimitazione della zona geografica; l’indicazione degli elementi comprovanti che la produzione, la trasformazione e l’elaborazione del prodotto hanno luogo nella zona delimitata; la descrizione del metodo di ottenimento del prodotto; d) gli elementi che comprovano il legame con l'ambiente geografico in particolare gli oliveti siti nelle zone di produzione di oli a denominazione di origine controllata, destinati alla produzione degli oli suddetti, devono essere iscritti in apposito albo pubblico degli oliveti, istituito presso ogni camera di commercio, industria, artigianato, agricoltura; e) i riferimenti relativi alle strutture di controllo: è stato infatti istituito il Comitato nazionale per la tutela della denominazione di origine controllata degli oli.

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19 Metodi analitici di accertamento dell’origine geografica su oli d’oliva
Panel Test, analisi di composti responsabili dell’aroma (Aparicio et al., 1996, J.Agric. Food Chem) Metodi chemiometrici applicati a diversi componenti dell’olio d’oliva (acidi grassi, steroli, alcoli alifatici e triterpenici, sostanza fenoliche, tocoferoli, trigliceridi e aromi). Forina e Tiscornia, Tsimidou et al., Alessandri et al., Webster et al., 2000 spettroscopia 13C-NMR e 1H-NMR ad alto campo (600 MHz) eseguita sull’olio tal quale (Sacchi et al., 1998; Mannina et al., 2000; Mannina et al., 2001) analisi dei rapporti tra isotopi stabili

20 Lavoro svolto da IASMA Nell’ambito della convenzione con il Ministero delle Politiche Agricole e Forestali: COSTITUZIONE DI BANCHE DATI ISOTOPICHE ANNUALI (dal 1998) 1998/1999: 80 campioni (Garda - Lombardia, Veneto, Trentino -, Liguria, Abruzzo, Toscana, Campania, Puglia, Sicilia, Sardegna) 2000/2001: 100 campioni (Garda, Liguria, Emilia Romagna, Toscana, Umbria, Lazio, Abruzzo, Campania, Puglia, Sardegna, Sicilia) 2001/2002: 84 campioni (Garda, Liguria, Emilia Romagna, Toscana, Umbria, Lazio, Abruzzo, Campania, Puglia, Sardegna, Sicilia): in via di completamento. 2002/2003: in via di raccolta campioni

21 Analisi effettuate

22 Valutazione statistica dei dati
Analisi univariata: determinazione di media, dev. std., minimo massimo, analisi della distribuzione dei dati (rappresentazione in box-plot wishker) e ANOVA (Test di differenze significative tra medie come Test di Tukey) Analisi bivariata: correlazione tra variabili Analisi multivariata ‘descrittiva’: Principal Component Analysis Analisi multivariata discriminante: Stepwise Discriminant Analysis: selezione delle variabili più significative Analisi Discriminante Canonica con rappresentazione grafica bidimensionale dei risultati Analisi Discriminante di riclassificazione