Modelling crescita microbica

Presentazione sul tema: "Modelling crescita microbica"— Transcript della presentazione:

1 Modelling crescita microbica

2 La crescita microbica Cosa è la crescita microbica? Valutiamo
Cellule totali (microscopio) “Corpuscoli” (Coulter counter, OD) Cellule vive (FACS, microscopio) Biomassa (peso secco) Cellule proliferanti (UFC) Attività metabolica (NADH, ATP,…)

3 Può esistere crescita disgiunta dalla duplicazione?
Biomassa Può esistere crescita disgiunta dalla duplicazione?

4 Modelli cinetici Utilità del modelling: una descrizione quantitativa dei processi cellulari permette l’ottimizzazione dei processi fermentativi. Resa e produttività sono due parametri misurabili, ma è molto più difficile predire come un cambio delle condizioni operative li possa modificare. La predizione è permessa da un modello matematico, ossia da una serie di relazioni tra le variabili del sistema. Relazioni: equazioni matematiche, espressioni logiche Variabili: agitazione, feed-rate, pH, temperatura, [S], [P], biomassa

5 Disegno del modello Dipende dall’uso: decidere il numero di reazioni da considerare e la loro stechiometria Kinetic expressions: le velocità delle reazioni considerate dal modello dipendono dalle variabili. Mass balance equations: descrivono come la materia entra, viene trasformata ed esce dal volume considerato (bioreattore); descrivono come cambiano nel tempo le concentrazioni. Simulazione del processo (assegnare parametri) Comparazione dati sperimentali Fitting dei parametri sperimentali (minimizzare la somma dei quadrati degli errori)

6 “As simple as possible but not simpler”
Complessità modello Complessità descrizione metabolismo e comportamento asincrono Modelli non strutturati biomassa Modelli strutturati Volume cellulare, età Compartimentazione reazioni; dettaglio reazioni enzimatiche Non strutturati Non segregati Strutturati Non segregati Descrizione popolazione Non strutturati Segregati Strutturati Segregati Descrizione cellule “As simple as possible but not simpler”

7 Modello più semplice di crescita
Fissione batterica binaria in mezzo omogeneo Generazione Tempo di generazione Crescita asincrona, media dei tempi Modalità batch, fbatch e continua

8 Crescita in batch 4 fasi classiche
Terminata la latenza, aumento della velocità di crescita fino alla vmax Descrizione: numero di cellule o biomassa

9 Valutazione biomassa La massa aumenta con un processo autocatalitico.
dX/dt=mX m = velocità di crescita specifica Volendo determinare m, integriamo: Xt=X0e m t Passando ai logaritmi naturali: LnXt=LnX0 +mt

10 Calcolo m Un grafico del logaritmo naturale della biomassa contro il tempo in fase esponenziale dà una linea retta con m come coefficiente angolare. Se uso i log10, il coefficiente angolare è uguale a m/2,303

11 Numero di cellule Ad ogni divisione, il numero di cellule raddoppia partendo da un inziale N0 Nt=N02n n=(LN(Nt)-LN(N0))/LN(2) td = t/n = t LN(2)/(LN(Nt)-LN(N0)) In crescita exp bilanciata dimensioni medie costanti, relazione tra numero di cellule e biomassa. Considerando che in un td la biomassa passa da x0 a 2x0 2x0=x0emtd ; LN(2x0)=LN(x0) + mtd ; mtd = LN (2) td = LN(2)/m

12 Velocità e rese Le velocità volumetriche di formazione prodotti e scomparsa substrati sono determinabili sperimentalmente Velocità specifiche (ri)sono ottenute normalizzando le volumetriche per la biomassa presente. Rese: quantità di substrato che viene recuperata in biomassa o prodotti. Definita come rapporto delle velocità specifiche. YSX=m/rs YSP=rp/rs Indicatore ultimo della distribuzione dei flussi metabolici Attenzione al senso (sX). YXS è la quantità di substrato convertito per unità di biomassa formata. RQ è la resa della CO2 sull’O2: rCO2/rO2

13 BLACK BOX Una singola reazione riassume tutte le reazioni della cellula. Tutte le rese sono quindi costanti La velocità di consumo del substrato è allora rs=YXSm Anche la formazione del prodotto, il consumo di ossigeno, etc, sono proporzionali alla m Come otteniamo l’entrata in stazionaria? Una singola cellula di E. coli che si duplica ogni 20’ in 43 ore occupa il volume della Terra, e in 45 ore ne eguaglia il peso

14 m in relazione a S m = mmax S/ (Ks + S)
Per un substrato limitante, la velocità dipende dalla concentrazione solo entro certi limiti. Un modo popolare per descrivere questo comportamento è il modello di Monod: m = mmax S/ (Ks + S)

15 Maintenance La resa non è costante al variare delle condizioni di crescita. “Metabolismo endogeno” Pirt: maintenance (ms), la resa può non essere costante rs= YtrueXSm+ms YSX=m/(YtrueXSm+ms) A bassi valori di m la resa in biomassa decresce perché una quota crescente di substrato è utilizzato per le necessità del mantenimento; se m è alta m è trascurabile e si torna alla formula originaria. rATP=YXATP+mATP

16 Mass Balances d(cs,iV)/dt = -rs,ixV + Fcfs,i-Foutcs,i
Combinare il modello cinetico con un modello del bioreattore. Accumulo= velocità di formazione + ingresso – uscita d(cs,iV)/dt = -rs,ixV + Fcfs,i-Foutcs,i F cfi Fout ci x V ci x

17 d(cs,i)/dt=-rs,ix + D(cfs,i- cs,i)
Mass Balances d(cs,iV)/dt=-rs,ixV + Fcfs,i-Foutcs,i Dividendo per V: d(cs,i)/dt=-rs,ix + Fcfs,i/V-Fout cs,i /V D = F/V dilution rate Fed batch: Fout =0 Batch e continuo F=Fout d(cs,i)/dt=-rs,ix + D(cfs,i- cs,i)

18 Batch dx/dt=mx ; x(t=0)=x0 dcs/dt=-rsx ; cs (t=0) = cs,0
Equazione diff primo ordine, si può calcolare la biomassa nel tempo. La biomassa si accrescerà nel tempo, consumando il substrato, in accordo con Monod, e l’andamento del substrato sarà in accordo con cs=cs,0 – YXS (x-x0) Poiché alla fine il substrato è 0: YSX=(xfinale-x0)/cs,0 Per definizione

19 Simulazione batch

20 (Ж) d(cs,i)/dt=-rs,ix + D(cfs,i- cs,i)
Chemostato (Ж) d(cs,i)/dt=-rs,ix + D(cfs,i- cs,i) dx/dt=mx-Dx; dx/dt = (m-D)x m=D x = YSX(cfs-cs): è possibile misurare precisamente la resa (la derivata (Ж)=0, YSX=m/rs) cs=DKs/(mmax-D): la concentrazione del substrato limitante aumenta con D Calcolo maintenance: x = D (cfs,i- cs,i)/(YtrueXSD +ms), regressione lineare.

21 d(cs,iV)/dt=-rs,ixV + Fcfs,i-Foutcs,i
Fed batch d(cs,iV)/dt=-rs,ixV + Fcfs,i-Foutcs,i D = dV/Vdt: se voglio mantenerlo costante feeding esponenziale: Fout = 0 quando t=0 d(xV)/dt = m0xV ; xV=x0V0em0t F(t)= YXSm0x0V0em0t/(cfs-cs) m0: la specifica velocità che voglio mantenere

22 Esempio pratico: produzione di interleukina in Z. bailii
Batch reactor Fed-batch reactor Variable Kinetic model Phases kinetic model Biomass mG = mmax G/(G+ksG) 0 = t <t* Fed A mA = costant 0≤ t ≤ tA mE = mmaxE E/(E+ksE) t>t* Fed B mB1 = mA exp [(tA-t)/tX] tA <t ≤ t1 mB2 = mA exp [(tA-t1)/tX] t >t1 Glucose qG = mG/YX/G 0 ≤ t <t* Fed A (qG)A = mA/(YXG)A 0 ≤ t ≤ tA Fed B (qG)B1= mB1/(YXG)B tA <t≤ t1 (qG)B2= mB2/(YXG)B t >t1 (YX/G)B = (YX/G)Aexp(-(t/tG)) EtOH (product) (qE)p = mGYE/X 0 ≤ t < t* — — EtOH (substrate) (qE)S = mE/YX/E t≥ t* — — IL-1b (qIL)G = mGYIL/X 0 ≤ t < t* Fed A (qIL)A = mA(YIL/X)A 0 ≤ t ≤ tA (qIL)E = mEYIL/X t ≥ t* Fed B (qIL)B1=mB1 (YIL/X)B tA <t ≤ t1 (qIL)B2=mB2 (YIL/X)B t >t1 (YIL/X)B = (YIL/X)A exp (-t/tIL)

23 Esempio pratico: produzione di interleukina in Z. bailii
Parameters used for simulations. Parameters Values Determination Batch mmaxG h-1 experimental and ref. [15] mmaxE h-1 by fitting YX/G (g g-1) experimental YX/E (g g-1) experimental YIL/X x106 (g g-1) experimental YE/X (g g-1) experimental kSG 15 (g l1) by fitting kSE 30 (g l1) by fitting Fed-batch (A) (YX/G)A (g g-1) experimental (YIL/X)A 1 x 105 (g g -1) experimental Fed-batch (B) tX h by fitting tG h by fitting tIL h by fitting

24 Fase batch

25 Fase fed batch

26 Dove sta il problema?

27 Fase fed batch