DIMOSTRAZIONE DELLA SEQUENZA DI REAZIONE: METEMOGLOBINA-EMOGLOBINA-OSSIEMOGLOBINA SU SEPHADEX G-25.

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1 DIMOSTRAZIONE DELLA SEQUENZA DI REAZIONE: METEMOGLOBINA-EMOGLOBINA-OSSIEMOGLOBINA SU SEPHADEX G-25

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4 His 58, His 87

5 metemoglobina La emoglobina tende ad ossidarsi, ma in circolo solo lo 0.5% di essa si trova sotto forma ossidata perché c’è un sistema enzimatico (metemoglobina riduttasi) che provede a trasformare la emoglobina ossidata (Fe 3+) in emoglobina ridotta (Fe 2+)

6 mancanza congenita di metemoglobina riduttasi varianti emoglobiniche
metemoglobinemie mancanza congenita di metemoglobina riduttasi varianti emoglobiniche

7 nature new biology 237, 259-263 (28 June 1972)
Subunit Interaction of Haemoglobin M Milwaukee M. F. PERUTZ1 ,  P. D. PULSINELLI2 &  HELEN M. RANNE IN four of the five different abnormal haemoglobins that cause methaemoglobinaemia, methaemoglobin reductase is ineffective, because either the proximal or the distal haem-linked histidines in one pair of subunits have been replaced by tyrosines.

8 HbM Boston HbM Iwate HbM Saskatoon HbM Hyde Park HbM Milwaukee
varianti catena  HbM Boston HbM Iwate HbM Saskatoon HbM Hyde Park HbM Milwaukee

9 mutazioni che provocano
His che interagiscono con l’eme mutazioni che provocano metemoglobinemie

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11 DIMOSTRAZIONE DELLA SEQUENZA DI REAZIONE:
METEMOGLOBINA-EMOGLOBINA-OSSIEMOGLOBINA SU SEPHADEX G-25 Materiali e soluzioni 1. Colonna cromatografica 1.5 cm (diametro interno)x 8 cm, preimpaccata con sephadex G-25(Pharmacia PD-10) 2. Pipette: 200 ml, 1000ml e pipetta pasteur 3. Eluente: tampone fosfato 20 mM, pH 7 4. Sangue intero con anticoagulante, ditionito di sodio (30mg/ml), ferricianuro di potassio (K3Fe(CN)6), metemoglobina preparata come riportato di seguito. Procedura sperimentale Fissare la colonna sull’apposito supporto. Preparare la soluzione di ditionito di sodio (30 mg in 1 ml di H2O distillata) e di metaemoglobina (diluire 0.5 ml di sangue intero a 2 ml con tampone fosfato; agitare fino a completa emolisi e poi aggiungere 15 mg di ferricianuro di potassio). Effettuare 3-4 lavaggi della colonna con tampone fosfato allo scopo di allontanare ogni traccia della azide sodica impiegata per preservare la colonna dall’azione batterica. A colonna chiusa applicare sul letto sephadex 100 ml di soluzione di ditionito , quindi eluire immediatamente raccogliendo 30 gocce di tampone fosfato. Chiudere la colonna ed applicare 200 ml di soluzione di metaemoglobina. Eluire. Risultati Questo esperimento dimostra non solo il principio della gel cromatografia (cromatografia ad esclusione) ma anche come poter rimuovere uno dei due prodotti di una reazione realizzata su colonna. Il ditionito di sodio (Na2S2O4), un sale a basso peso molecolare, viene applicato come un disco molto stretto sulla sommita’ della colonna. La metaemoglobina, essendo una sostanza ad alto peso molecolare, viene esclusa dalle particelle porose di sephadex G-25 e pertanto si muove attraverso gli spazi interstiziali. In pratica la metaemogloina migra piu’ velocemente del ditionito di sodio e del ferricianuro di potassio (che è presente in eccesso). Nel corso del movimento dei diversi soluti attraverso la colonna è possibile osservare i seguenti cambiamenti: le metaemoglobina (banda marrone) si separa dall’eccesso di ferricianuro di potassio (banda gialla) e si trasforma in emoglobina banda di color porpora) non appena è ridotta dal ditionito. A sua volta, l’emoglobina lascia la zona del ditionito sotto forma di banda porpora ed è quindi rapidamente trasformata in ossiemoglobina, di color scarlatto, ad opera dell’ossigeno disciolto nell’eluente (tampone fosfato). Queste reazioni possono essere così schematizzate: emoglobina + K3Fe(CN)6= metaemoglobina metemoglobina + Na2S2O4 = emoglobina emoglobina +O2 = ossiemoglobina

12 CROMATOGRAFIA Tecnica di separazione di molecole tra FASE STAZIONARIA FASE MOBILE La separazione si ottiene perché le sostanze migrano con diversa velocità attraverso la fase stazionaria La migrazione è provocata dal flusso della fase mobile o eluente

13 FASE STAZIONARIA Particelle di determinate dimensioni impaccate su colonna o stratificate su un supporto solido (strato sottile) FASE MOBILE Viene fatta scorrere attraverso la fase stazionaria SOSTANZE Vengono trasportate lungo la fase stazionaria dalla fase mobile

14 CROMATOGRAFIA AD ADSORBIMENTO: le sostanze interagiscono con la superficie delle
particelle costituenti la fase stazionaria CROMATOGRAFIA DI PARTIZIONE: le sostanze si separano in base alla diversa ripartizione tra fase stazionaria e fase mobile GEL CROMATOGRAFIA (ad esclusione molecolare): La fase stazionaria è rappresentata da un GEL, attraverso cui scorre l’eluente GEL: viene preparato permettendo il rigonfiamento delle particelle in eccesso di eluente Generalmente la matrice del gel possiede gruppi idrofilice (-OH) Il gel viene impaccato mediante il passaggio di eluente attraverso di essa

15 Sephadex E’ costituito da DESTRANO, un polisaccaride costituito
da residui di glucosio Viene prodotto da ceppi differenti di Leuconostoc mesenteroides che crescono in un medium contenente saccarosio Successivamente il destrano viene polimerizzato con EPICLOROIDRINA

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18 Tre stadi nel corso della separazione
low molecular weight high molecular weight Gel particles Principio di ripartizione: le molecole piccole possono entrare nel gel attraverso i grani della fase stazionaria (equilibrio dinamico) le molecole più grosse passano attraverso i grani di gel senza interagire con esso il sistema può essere complicato a causa di particolari interazioni con la matrice del gel

19 Aggiungo prima ditionito di sodio Poi metaemoglobina
ESERCITAZIONE K 3Fe(CN)6 Na2S2O4 Sangue metaemoglobina emoglobina emoglobina ossigenata Fe(III) marrone Fe(II) rosso porpora rosso +3 4H2O +6 6Fe3++S2O42- 2SO H+ + 6Fe2+ Aggiungo prima ditionito di sodio Poi metaemoglobina metaemoglobina marrone ditionito rosso porpora rosso

20 La metaemoglobina è più veloce e raggiunge il ditionito tornando
allo stato di ossidazione Fe(II) assumendo quindi la colorazione rossa e successivamente rosso più chiaro grazie alla presenza di Ossigeno nelle soluzioni in colonna